汪冬吟，黃秋玲，陳麗鳳，陳志民

銀杏葉主要含黃酮類、酚酸類等化合物，其藥理作用為抗氧化、清除自由基、增加血流量及神經(jīng)保護等[1-3]。氯吡格雷是腺苷二磷酸受體的一種抑制藥，能抑制血小板的相互聚集[4]，是臨床常用抗血小板聚集藥物之一。然而，氯吡格雷是僅有15%在肝臟CYP450 酶作用下轉化為活性代謝產(chǎn)物，而其余轉化為非活性代謝產(chǎn)物氯吡格(SR-26334)，發(fā)揮藥理作用[5]。實驗室以大鼠為研究對象，發(fā)現(xiàn)銀杏葉片對氯吡格雷的生物利用度和吸收總量具有顯著的增強作用，兩藥合用對心臟功能有顯著的改善作用[6，7]。P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)在藥物的吸收、分布和排泄等過程中發(fā)揮著重要作用。研究表明，藥物可通過抑制P-gp功能影響藥物吸收或利用度等[8]。因此，本研究建立體外Caco-2 細胞模型，經(jīng)過具有熒光性質的P-gp底物羅丹明-123(Rhodamine 123，Rho-123 )和各藥物單獨或聯(lián)合處理，測定各組熒光強度變化，評價各藥對P-gp功能的影響，從而對其相關機制研究。

1 對象與方法

1.1 對象 選取14名男性健康受試者，年齡20～23歲，體重60～63 kg；入選標準：(1)無藥物過敏史、藥物依賴史、慢病史，無煙、酒嗜好；(2)血壓、脈搏等生命體征檢查均正常，心電圖檢查及血、尿常規(guī)和肝、腎功能等檢查均在正常值范圍；(3)近兩周內，未服用過影響本研究吸收、代謝的藥物；(4)均簽署知情同意書。試驗期間受試者統(tǒng)一清淡飲食，并聘請一名具有GCP結業(yè)證書的主治醫(yī)師與2名具有多年工作經(jīng)驗的護士進行實時觀察藥物的不良反應。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會通過。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器 銀杏葉片(購于江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，批號：160804)，硫酸氫氯吡格雷(購于賽諾菲制藥有限公司，批號：20160104)；SR26334 標準對照品(由深圳信立泰制藥有限公司提供，純度為99.2%)。維拉帕米鹽酸鹽、Rho-123、二甲基亞砜均購于sigma。Mettler電子天平、臺式冷凍離心機、渦旋混合器、島津LC-20A(配置自動進樣系統(tǒng)和二極管陣列檢測器；島津，日本)、XW-80A型微型渦旋混合儀(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)。Millipore流式細胞儀(北京維欣儀奧科技發(fā)展有限公司)。Caco-2細胞株，由中國科學院上海細胞庫提供。

1.2.2 實驗方案 受試者在第1階段單獨服用氯吡格雷150 mg/d(75 mg/片)，之后經(jīng)過14 d洗脫期；第2段連續(xù)服用銀杏葉片240 mg/ d(60 mg/粒膠囊)14 d，第14天服用銀杏葉片1 h后，所有受試者空腹服用氯吡格雷；分別在第1階段和第2階段服用氯吡格雷后采集受試者0、0.5、1、2、3、4、5、6、8、10、12、24 h外周靜脈血，分離血漿待測。服藥后受試者均在觀察室內休息，避免劇烈運動和長時間臥床等影響受試者安全與健康的行為。

1.2.3 色譜條件 色譜柱：Zorbax SB-C18(2.1 mm×50 mm，3.5 μm)；流動相為乙腈∶水∶0.1% TFA=24∶56∶20(體積比)；檢測波長為230 nm和280 nm；流速為1.0 ml/min；柱溫：40 ℃，進樣量：10 μl。

1.2.4 樣品預處理方法 采集不同時間段的血液于肝素抗凝管中，離心10 min，取上清，-20 ℃保存，待測。精密吸取待測血漿樣品200 ml，3000 r/min離心5 min，取100 ml上清，加10 μl的莫西沙星內標工作液(濃度為400 mg/L)，再加入10 μl的70%高氯酸，渦旋混勻，13 000 r/min離心5 min，取上清，進液相檢測。另同法制備空白血漿和空白血漿+ SR26334標準品+莫西沙星內標樣品，進液相檢測，計算不同時間受試者血藥濃度。

1.2.5 血漿標準曲線制備 向空白血漿中，加入不同濃度的SR26334 標準工作溶液，配制成濃度相當于0.5、1、2.5、5、10、25、50 μg/ml的血漿樣品，并按上述血漿樣品處理方式進行處理之后進液相檢測，繪制標準曲線。

1.2.6 精密度、回收率及穩(wěn)定性實驗 (1)精密度考察：制備SR26334濃度為20、1000、4000 μg/ml標準品血漿溶液，處理方法同“2.3”項下，同一天內不同時間處理樣品并測定5次，考察日內精密度。處理方法同日內，連續(xù)5 d，每天同一時間測定1次，考察日間精密度。(2)回收率考察：制備SR26334血漿標準品溶液濃度為20、1000、4000 μg/ml，處理方法同“2.3”項下，按照“2.4”項下所得標準曲線求得的SR26334濃度與加入的已知濃度相比，計算相對回收率。另用甲醇配制上述濃度對照品，不經(jīng)血漿樣品處理直接進樣計算SR26334與內標峰面積之比為標準，與經(jīng)過血漿樣品處理所得樣品峰與內標峰面積比作比較，得絕對回收率。(3)穩(wěn)定性實驗：制備SR26334血漿標準品溶液濃度為20、1000、4000 μg/ml，處理方法同“2.3”項下。分別在室溫放置24 h、凍-融3次、長期凍存7 d，測定RSD。

1.2.7 銀杏葉提取物和氯吡格雷對P-gp功能的影響 參考文獻[9]方法，培養(yǎng)細胞并建立Caco-2細胞模型。用0.25%的胰蛋白酶處理對數(shù)生長期的Caco-2，離心，用PBS制備細胞懸液，并將細胞密度調整為1×106count/ml。取0.5 ml細胞懸液，離心，去掉上清，再通過不同的藥物(表1)進行處理后，于37 ℃、含5%的CO2的培養(yǎng)箱中孵育1 h，之后冰上終止處理。于4 ℃，1000 r/min，離心5 min，棄上清，用冰PBS洗滌兩次，加入2 μg/ml Rho-123或PBS，于37 ℃、含5%的CO2的培養(yǎng)箱中，孵育1 h后，冰上終止轉運。4 ℃，1000 r/min，離心5 min，棄上清，加冰PBS洗滌2次，加PBS重懸。通過流式細胞儀檢測細胞檢測Rho-123熒光強度。激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為488 nm和535 nm，各組熒光強度用其對照熒光強度校正，每個濃度分別重復3次。

表1 銀杏葉提取物對氯吡格雷人體內藥動學實驗的分組與給藥情況

1.3 統(tǒng)計學處理 藥-時曲線數(shù)據(jù)用Drug And Statistics of Windows 2.0(DAS 2.0)軟件處理；采用SPSS 20.0軟件統(tǒng)計處理數(shù)據(jù)，采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 方法專屬性 在給定的色譜環(huán)境下，空白血漿、標準加樣血漿和聯(lián)合用藥2 h 的血漿樣品色譜見圖1。在本研究條件下，氯吡格雷酸及內標非那西汀色譜分離良好，內標保留時間為5.6 min，氯吡格雷酸保留時間為9.2 min(圖1)。

圖1 人體內藥動學實驗氯吡格雷酸及內標非那西汀血漿色譜

2.2 標準曲線和線性范圍 根據(jù)血漿標準曲線所測結果，得回歸方程為：Y= 0.512X+ 0.0314(R2 =0.9996)。結果表明，血漿中氯吡格雷酸在0.5～50 μg/ml 濃度范圍內具有較好的線性關系。

2.3 精密度、回收率及穩(wěn)定性實驗結果 日內精密度為4.25%，日間精密度4.33,均小于6%。相對回收率(98.22%)在89.66%～101.77%，絕對回收率(97.23%)88.34%～98.88%。樣品室溫放置24 h、凍-融循環(huán)3 次和長期凍存14 d測定RSD分別為8.55%、8.48%、8.89%，均小于15%，提示氯吡格雷酸在血漿中穩(wěn)定，即滿足測定要求。

2.4 藥動學參數(shù)

2.4.1 藥時曲線 給藥后分別于0.09，0.5，1，2，3，4，5，6，8，10，12，24 h取血處理，用HPLC 法測得不同時間的SR26334血漿藥物濃度，繪制藥時曲線。兩組SR26334 平均血藥濃度-時間曲線比較，結果表明聯(lián)合用藥組SR26334的血漿峰值和曲線下面積高于單獨用藥組，即單獨用藥組清除率快于聯(lián)合用藥組(圖2)。

圖2 兩組人體內藥動學實驗SR26334平均血藥濃度-時間曲線

2.4.2 藥動學參數(shù) 通過DAS軟件處理SR26334的血漿濃度，用非房室模型估算藥動學參數(shù)：血漿藥物峰值濃度(Cmax)、達峰時間(Tmax)、半衰期(T1/2)、清除率(CL/F)；兩組的AUC(0-t)、AUC(0-∞)、Cmax經(jīng)對數(shù)化處理， T1/2和CL/F采用DAS統(tǒng)計數(shù)據(jù)。結果表明與單獨用藥組相比，聯(lián)合用藥組中SR26334的AUC(0-t)、AUC(0-∞)和Cmax值均顯著降低(P<0.05,表2)，而CL/F顯著升高(P<0.05)，Tmax、t1/2z差異無統(tǒng)計學意義。

表2 氯吡格雷酸的主要藥動學參數(shù) ±s)

注：聯(lián)合用藥組與單獨用藥組比較,①P<0.05

2.5 銀杏葉提取物和氯吡格雷對P-gp功能的影響 與羅丹明組相比，不同濃度的氯吡格雷組熒光強度均無統(tǒng)計學意義，而不同濃度的銀杏葉提取物組中，高劑量銀杏葉提取物組熒光強度顯著升高(P<0.05，表3)。同時結果發(fā)現(xiàn)高劑量的銀杏葉提取物和高劑量氯吡格雷聯(lián)合用藥即聯(lián)合用藥組熒光強度顯著升高(P<0.05)。

表3 各組細胞熒光強度檢測結果 ±s)

注：聯(lián)合用藥組中氯吡格雷組和銀杏葉提取物組均為100 μg/ml。與羅丹明組比較，①P<0.05

3 討 論

銀杏葉是臨床常用的中草藥，主要含黃酮類、酚酸類等化合物，其藥理作用為抗氧化、清除自由基、增加血流量及神經(jīng)保護等[1]。氯吡格雷常常聯(lián)合用藥，有研究通過對氯吡格雷聯(lián)合阿托伐他汀鈣用于TIA患者發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合用藥效果明顯優(yōu)于單用氯吡格雷[7-10]；文獻[11]通過觀察氯吡格雷聯(lián)合阿司匹林治療穩(wěn)定型心絞痛伴糖尿病的臨床的療效，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥具有更好的療效。目前研究表明氯吡格雷與銀杏葉片兩藥合用具有較好的療效，如對心臟功能具有顯著的作用[6]；同時研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥影響其生物利用，如長期用銀杏葉提取物對氯吡格雷生物利用度和吸收總量有一定影響[7]。然而目前對于人體內兩者代謝相互作用未見研究報道。研究表明氯吡格雷在肝臟CYP450 酶作用下僅有15%左右轉化為活性代謝產(chǎn)物，而其余轉化為非活性代謝產(chǎn)物SR-26334，發(fā)揮藥理作用[5]。從而得出SR26334是氯吡格雷的主要代謝物，故通過檢測SR26334濃度觀察氯吡格雷機內的代謝變化。本研究通過銀杏葉提取物對人體內氯吡格雷藥動學影響，將實驗分為兩個階段，單獨服用氯吡格雷和連續(xù)服用銀杏葉提取物后繼而服用氯吡格雷，對比服用銀杏葉提取物前后體內血中SR26334相關藥代參數(shù)，以期為臨床銀杏葉提取物和氯吡格雷的聯(lián)合用藥提供理論依據(jù)。本文實驗結果表明，長期服用銀杏葉片有助于提高氯吡格雷在人體內的利用度和吸收總量。

藥物代謝主要肝臟中進行，在此過程中CYP450起著至關重要的作用，其中最重要的是CYP3A亞族。然而研究表明CYP3A酶系與P-gp具有相同的組織分布和底物。P-糖蛋白(P-gp)是一種轉運藥物分子進出細胞的外排蛋白，在動物體內廣泛存在，在器官和正常組織如腎臟、肝臟及腸道等中有著豐富的表達[12]。研究表明銀杏葉片中槲皮素、山奈酚等黃酮類化合物對P-gp功能具有抑制作用，它也可通過與外排轉運體和代謝酶的相互作用而影響底物的吸收[13，14]。在體內，銀杏葉片和氯吡格雷均為P-gp的底物，并且影響氯吡格雷在十二指腸吸收的主要因素也是P-gp。因此我們進一步進行體外實驗，以期研究相關機制。目前人結腸腺癌細胞(Caco-2)常用于藥物轉運機制研究[15]。本研究通過建立體外模型，研究銀杏葉提取物和氯吡格雷對P-gp的作用，結果表明氯吡格雷組熒光強度無顯著變化，而銀杏葉提取物組和聯(lián)合用藥組熒光強度顯著升高，即表明單用氯吡格雷時對P-gp無顯著抑制作用，而單用銀杏葉提取物或聯(lián)合氯吡格雷用藥呈現(xiàn)明顯的抑制作用，該結果提示銀杏葉提取物對P-gp有較強的抑制作用。結合我們前期藥動學實驗結果，可以推測長期服用銀杏葉片能增加氯吡格雷在人體內的吸收總量，氯吡格雷在人體內吸收總量的增加可能與銀杏葉片對P-gp的抑制有關。

綜上所述，本文研究銀杏葉提取物對人體內氯吡格雷藥動學影響，結果表明相關機制可能是銀杏葉提取物抑制P-gp的功能導致，這對臨床用藥具有一定的指導意義。但本研究還存在一定的局限性，對相關機制研究僅局限于體外細胞模型，發(fā)現(xiàn)銀杏葉片對P-gp抑制的作用，并未闡明其是否在人體內具有抑制作用，有待進一步研究。