燕晨宇，張 翔，秦民堅*

(1．南京市寧海中學(xué)，江蘇 南京 210024；2.中國藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，江蘇 南京 211198)

射干[Belamcandachinensis(L.) DC.]是鳶尾科(Iridaceae)多年生草本植物，常以干燥根莖入藥,具有清熱解毒，消痰，利咽的功效[1]?，F(xiàn)代研究表明射干主要活性成分是異黃酮類化合物如鳶尾苷，鳶尾甲苷，野鳶尾苷等[2-3]，具有抗炎[4]、抗氧化[5]、抗病毒[6]、清除自由基[7]、雌激素樣作用[8]，在治療心血管系統(tǒng)疾病、骨質(zhì)疏松等疾病[9]方面具有很好的前景。以射干葉片、莖尖、假莖、腋芽、幼莖誘導(dǎo)愈傷組織已有報道[10-13]，尚未見以射干無菌苗真葉、花蕾誘導(dǎo)愈傷組織的報道。本文以射干真葉、花蕾為外植體，探索不同濃度激素配比及AgNO3濃度對射干愈傷組織誘導(dǎo)的影響，高效愈傷組織誘導(dǎo)條件的獲得將為后續(xù)射干細(xì)胞懸浮體系的成功構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

射干種子和花蕾采自中國藥科大學(xué)藥用植物園鳶尾科種質(zhì)資源圃。實驗材料經(jīng)中國藥科大學(xué)秦民堅教授鑒定為射干[Belamcandachinensis(L.) DC.]，憑證標(biāo)本存放于中國藥科大學(xué)中藥資源系。

1.2 方法

1.2.1 射干無菌苗真葉的獲取

挑選飽滿、無病變的射干種子，搓去射干外種皮，流水沖洗干凈，75%乙醇處理30 s，無菌水沖洗1次，然后用2% NaClO溶液浸泡15 min，期間振蕩數(shù)次，無菌水沖洗5次，播種于MS(含3%蔗糖、0.55%瓊脂粉，pH值為5.8)基本培養(yǎng)基上，置于光照培養(yǎng)箱1 500 lx，(25±1)℃，兩周左右射干種子開始陸續(xù)萌發(fā)，20天后，取射干真葉作為外植體備用。

1.2.2 射干花蕾的滅菌

取射干的花蕾，用軟刷清洗材料表面，流水沖洗30 min后移至超凈工作臺。75%乙醇溶液浸泡30 s，無菌水沖洗，然后用2% NaClO溶液浸泡10 min，期間不斷搖動，無菌水沖洗5次，作為外植體備用。

1.2.3 射干愈傷組織的誘導(dǎo)

以MS 為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的2,4-D、6-BA、NAA、AgNO3配置為射干真葉的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基；添加不同濃度的2,4-D、6-BA、NAA、KT配置為射干花蕾的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(均含3%蔗糖，0.55%瓊脂粉，pH值為5.8)。 將真葉、花蕾剪切成為0.5～1.0 cm的切塊分別接入各自誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其中每個培養(yǎng)皿接種7～8個外植體，每個處理10個重復(fù)，(25±1) ℃黑暗培養(yǎng)，接種7天后每天觀察并記錄射干愈傷組織的形成情況，包括最早形成時間、顏色和質(zhì)地等，60天后統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.2.4 射干愈傷組織類型的鑒定

挑取一小塊射干愈傷組織于載玻片上，搗碎，加1～2滴1 mol·L-1鹽酸水解5 min, 吸水紙吸干鹽酸，水洗3次，每次用吸水紙吸干，加1滴卡寶品紅染色劑染色5 min，加蓋玻片壓片，Olympus IX71光學(xué)顯微鏡下觀察愈傷組織的細(xì)胞形態(tài)特征。

2 結(jié)果與分析

2.1 射干愈傷組織的形成

射干真葉愈傷組織總體啟動較慢，接種2周后，觀察到部分射干真葉卷曲，接著在切口處漸漸有凸起物，并逐漸向外植體中部不斷擴展，30 d后陸續(xù)觀察到愈傷組織的出現(xiàn)(圖1 A)，其中附加2,4-D 1.0 mg·L-1、6-BA 1.5 mg·L-1、NAA 1.0 mg·L-1、AgNO315 mg·L-1的組合為真葉愈傷組織誘導(dǎo)率最高的組合(處理1-6)，為62.5%，見圖1B。以花蕾為外植體誘導(dǎo)的愈傷組織，其中附加的2, 4-D、6-BA、NAA濃度都是1.0 mg·L-1的培養(yǎng)基，其愈傷組織誘導(dǎo)率最高(處理2-6)，為64.5%，見表2，總體上，花蕾為外植體的愈傷組織啟動時間早于真葉，20 d可以明顯觀察到愈傷組織的出現(xiàn)(圖1 C、D)。

誘導(dǎo)射干愈傷組織的時候，不同激素的添加，不僅僅是為了獲得較高的出愈率，也是為了控制愈傷組織的質(zhì)量。射干愈傷組織以黃色、淡黃色、黃白色為主，淡黃色的愈傷組織含有粘液或水漬狀，生長緩慢且不均勻，部分黃白色的愈傷組織培養(yǎng)時間長會發(fā)生褐變現(xiàn)象。通過對射干愈傷組織進(jìn)行鏡檢(圖2)，發(fā)現(xiàn)其主要分為兩類細(xì)胞：一類是細(xì)胞呈圓形或橢圓形，細(xì)胞形狀規(guī)則，內(nèi)含物豐富，但生長速度一般的胚性愈傷組織，另一類是細(xì)胞不規(guī)則，表面結(jié)構(gòu)疏松，有較多覆蓋物，其內(nèi)幾乎無細(xì)胞器，生長速度較快的非胚性愈傷組織。

圖1 射干愈傷組織特征(A、B:真葉形成的愈傷組織；C、D：花蕾形成的愈傷組織)

表1 不同激素及AgNO3濃度對射干真葉愈傷組織誘導(dǎo)的影響

注：“+”表示生長一般,“++”表示愈傷組織生長較好,“+++”表示生長良好；“-”表示無現(xiàn)象

圖2 射干胚性與非胚性愈傷組織細(xì)胞(400×)

2.2 不同激素、硝酸銀濃度對射干愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表1、2可以得出，當(dāng)不加入2,4-D時，射干真葉與花蕾的愈傷組織誘導(dǎo)率都為0，可見 2,4-D對射干愈傷組織的誘導(dǎo)起著至關(guān)重要的作用；同時隨著2,4-D濃度的增加，真葉與花蕾的愈傷組織誘導(dǎo)率逐漸下降，其中處理1-9中，愈傷組織的誘導(dǎo)率僅為4.0%，綜合實驗結(jié)果，射干真葉與花蕾都以2,4-D濃度為1.0 mg·L-1時愈傷組織的誘導(dǎo)率最高，這與路易斯鳶尾[14]誘導(dǎo)愈傷組織的研究結(jié)果基本一致。

表2 不同激素組合對射干花蕾愈傷組織誘導(dǎo)的影響

注：“+”表示生長一般,“++”表示愈傷組織生長較好,“+++”表示生長良好；“-”表示無現(xiàn)象

由表1對比可以得出，當(dāng)AgNO3濃度在0～20 mg·L-1內(nèi)，隨著加入量的增加，愈傷組織的誘導(dǎo)率逐漸提高。當(dāng)AgNO3濃度為15 mg·L-1時，射干愈傷組織的誘導(dǎo)率達(dá)到最高，為62.5%。本實驗結(jié)果表明AgNO3對射干真葉愈傷組織的誘導(dǎo)有一定的影響，結(jié)合愈傷組織的顯微觀察，認(rèn)為AgNO3可能對射干胚性愈傷組織的誘導(dǎo)有一定的作用，這與張慧英等[12]的研究結(jié)果相一致。

綜合表1、表2，得出射干真葉愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為：MS+2,4-D 1.0 mg·L-1+6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 1.5 mg·L-1+ AgNO315 mg·L-1，花蕾愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為：MS+2,4-D 1.0 mg·L-1+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1，比較發(fā)現(xiàn)射干花蕾的愈傷組織誘導(dǎo)率略高于真葉，誘導(dǎo)的激素水平整體比真葉略低，不需要添加KT，可能由于射干花蕾孕育開花，內(nèi)源激素水平比較高的緣故。

3 討 論

(1)采用射干無菌苗真葉作為外植體可以直接進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)，從而緩解了采用外界射干葉片、莖尖、假莖等作為外植體時污染率較高的問題。

(2)射干愈傷組織有胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織兩種，在條件合適的情況下，可以相互轉(zhuǎn)化。在植物體細(xì)胞胚發(fā)生過程中，激素發(fā)揮了非常重要的作用，其中以生長素的作用尤為重要，細(xì)胞分裂素起到了協(xié)同作用，2,4-D是誘導(dǎo)胚性愈傷組織的重要激素[17],陳以峰等在針對水稻體細(xì)胞胚發(fā)生的研究顯示，2,4-D 通過促進(jìn)內(nèi)源性的IAA含量提高，誘導(dǎo)了水稻胚性細(xì)胞的形成。

(3)AgNO3對誘導(dǎo)射干胚性愈傷組織有一定的作用。目前，AgNO3用于藥用植物愈傷組織誘導(dǎo)的報道較少， AgNO3作為乙烯合成的抑制劑可有效防止植物細(xì)胞在離體培養(yǎng)中乙烯的積累對外植體生長和不定芽分化的影響，在植物離體培養(yǎng)時培養(yǎng)基中添加AgNO3可明顯促進(jìn)器官發(fā)生、體細(xì)胞胚形成和離體植株的再生[18-19]。

(4)胚性愈傷組織具有親本的遺傳特性，不論在離體快繁、種質(zhì)保存、細(xì)胞工程、遺傳轉(zhuǎn)化，還是在細(xì)胞水平上的生理生化、原生質(zhì)體、離體誘變等研究方面都具有獨特的應(yīng)用[20]。射干愈傷組織的誘導(dǎo)體系建立，為后續(xù)射干體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)與細(xì)胞懸浮培養(yǎng)等的研究提供了良好的基礎(chǔ)。