齊悅 龔樹(shù)生

線粒體是細(xì)胞有氧呼吸的主要場(chǎng)所，為細(xì)胞和組織提供生命活動(dòng)所必需的能量，是人類最重要的細(xì)胞器之一。線粒體在葡萄糖和脂肪的代謝，氧化磷酸化及細(xì)胞凋亡等過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[1，2]，線粒體功能的異?？蓪?dǎo)致老化[3]及多器官多系統(tǒng)的疾病[4，5]。線粒體基因不受組蛋白保護(hù)，因此具有高突變率[6]，常導(dǎo)致母系遺傳的先天性疾病；此外，線粒體也是最易受環(huán)境有害因素攻擊的細(xì)胞器之一，目前研究證實(shí)線粒體功能障礙與心血管疾病[7]、肥胖[8]、糖尿病[9]、神經(jīng)系統(tǒng)和肌退行性疾病[10，11]、綜合征型和非綜合征型耳聾[12，13]等多種常見(jiàn)病以及部分罕見(jiàn)病[14]相關(guān)。

目前臨床上尚無(wú)有效的治療方法治愈線粒體疾病。近年來(lái)，通過(guò)植入外源性線粒體或外源性線粒體DNA糾正先天性線粒體遺傳病及后天性線粒體功能障礙成為新的研究熱點(diǎn)。2016年，Kang等[15]成功地通過(guò)線粒體置換技術(shù)對(duì)人卵母細(xì)胞的線粒體DNA 致病突變進(jìn)行糾正，這項(xiàng)研究成為線粒體遺傳病治療上的重大突破；然而無(wú)論是技術(shù)難度，還是涉及的倫理問(wèn)題和潛在的重大風(fēng)險(xiǎn)都使其難以在臨床上推廣。最新研究發(fā)現(xiàn)在成熟的體細(xì)胞周圍植入外源性線粒體，也可使線粒體功能缺陷的細(xì)胞和組織恢復(fù)線粒體功能[16]；這種外源性線粒體的植入主要有兩種，即植入攜帶正常線粒體的細(xì)胞和植入獨(dú)立的功能性線粒體。外源性線粒體植入的治療作用已在多種線粒體疾病動(dòng)物模型上得以證實(shí)[17，18]，為線粒體疾病提供了一種新的治療方向。本文對(duì)外源性線粒體植入的相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，旨在探討外源性線粒體植入對(duì)線粒體疾病的治療效果及作用機(jī)制，并為其應(yīng)用于線粒體聾病的治療提供理論依據(jù)。

1 外源性細(xì)胞內(nèi)線粒體的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)及治療意義

2006年，Spees等[16]對(duì)是否能通過(guò)植入外源性線粒體或線粒體DNA(mtDNA)，使其跨細(xì)胞轉(zhuǎn)移進(jìn)入無(wú)線粒體功能的細(xì)胞并進(jìn)行線粒體功能修復(fù)進(jìn)行了研究，研究通過(guò)溴化乙錠使細(xì)胞的mtDNA產(chǎn)生突變并喪失功能，成為無(wú)法有氧呼吸和生長(zhǎng)的A549細(xì)胞，然后將人骨髓非造血祖細(xì)胞(stem/progenitor cells from human bone marrow，hMSCs)和成纖維細(xì)胞分別與這種線粒體缺陷的A549細(xì)胞共孵育，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)出了攜帶有功能線粒體的A549細(xì)胞，這些功能線粒體來(lái)自于hMSCs和成纖維細(xì)胞，提示細(xì)胞間出現(xiàn)了線粒體的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)移并可恢復(fù)A549細(xì)胞的有氧呼吸功能。這種通過(guò)獲取其他類型細(xì)胞的外源性線粒體來(lái)恢復(fù)細(xì)胞自身線粒體缺陷的現(xiàn)象，隨后在Tan等[19]的動(dòng)物在體實(shí)驗(yàn)中也得到了證實(shí)，2014年Tan等將缺乏mtDNA的腫瘤細(xì)胞皮下注射到同種系小鼠后，這些原本喪失了增殖功能的腫瘤細(xì)胞逐漸恢復(fù)了增殖能力，研究在增殖的腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了宿主小鼠的mtDNA及具有功能的線粒體。

在離體細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中已有研究證實(shí)了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived stromal cells，BMSCs)可將正常的線粒體轉(zhuǎn)移到有線粒體缺陷的內(nèi)皮細(xì)胞、A549細(xì)胞以及心肌細(xì)胞[16，20，21]，但在活體肺中，外源性BMSCs的線粒體轉(zhuǎn)移及其潛在的治療效果尚待研究；Islam等[18]建立了急性肺損傷的動(dòng)物模型，并對(duì)活體肺灌注健康的BMSCs，發(fā)現(xiàn)灌注的BMSC首先附著于肺泡，在隨后的24小時(shí)內(nèi)BMSC將線粒體逐漸的轉(zhuǎn)移到肺泡上皮細(xì)胞，并顯著增加了肺泡的ATP水平，對(duì)肺組織的急性期損傷可起到積極的保護(hù)作用。

隨著研究的進(jìn)展，這種外源性線粒體的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)在越來(lái)越多的細(xì)胞類型中被發(fā)現(xiàn)和證實(shí)。在Robicsek等[22]的研究中，外源性線粒體可以自發(fā)的進(jìn)入多種類型細(xì)胞，繼而可改善受體細(xì)胞受損的線粒體功能，這種外源性線粒體進(jìn)入不同類型細(xì)胞的過(guò)程常在數(shù)分鐘內(nèi)即可完成。上述研究結(jié)果提示線粒體的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)并不是某種細(xì)胞特有的功能，而可能是細(xì)胞普遍具有的能力。

2 孤立外源性線粒體的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)及治療意義

相對(duì)于細(xì)胞而言，注射直徑僅4～6 nm大小的線粒體可顯著減少因注射而造成的機(jī)體損傷，并且可減少免疫排斥反應(yīng)，更適宜應(yīng)用于在體研究。目前研究已證實(shí)，局部缺血可導(dǎo)致線粒體損傷和功能障礙，這些受損的線粒體在再灌注過(guò)程中會(huì)對(duì)細(xì)胞生存產(chǎn)生負(fù)面影響[23，24]。為了減少這種負(fù)面影響，2008年McCully等[17]從未受損的兔心肌組織分離提取出了形態(tài)完整且具有功能的孤立線粒體，將其直接注射到自體缺血的心肌組織中，2小時(shí)后的檢測(cè)結(jié)果顯示注射的外源性線粒體仍存活并保持著完好的膜電位和功能，同時(shí)有效的減少了肌酸激酶、肌鈣蛋白Ⅰ等反映心肌損傷的指標(biāo)和心肌的梗死面積，并且沒(méi)有造成心律失常等不良反應(yīng)；然而，這項(xiàng)研究中注入的外源性線粒體聚集在心外膜表面的心肌纖維間而沒(méi)有進(jìn)入肌細(xì)胞。2013年Masuzawa等[25]在該項(xiàng)研究的基礎(chǔ)上采用上述方法從兔胸大肌組織中分離出具有功能的孤立線粒體，并直接注射到自體缺血的心肌組織,和前述研究相比，該研究延長(zhǎng)了注射后的線粒體觀測(cè)時(shí)間，發(fā)現(xiàn)移植的外源性線粒體先在心肌細(xì)胞間隙明顯聚集，2 h后附著在心肌細(xì)胞表面，在移植后的8～24小時(shí)外源性線粒體逐漸被整合到心肌細(xì)胞中被心肌細(xì)胞所內(nèi)化，進(jìn)而減少心肌細(xì)胞的凋亡和心肌梗死面積。同年，Lin等[26]將分離出的外源性線粒體用于減輕大鼠缺血再灌注的肝損傷,缺血后再灌注損傷是肝移植和肝切除術(shù)面臨的一個(gè)臨床難題;該研究從鼠的肝細(xì)胞中分離出獨(dú)立的線粒體并注射到脾囊膜區(qū)域，這些外源性線粒體經(jīng)脾靜脈回流進(jìn)入肝臟門(mén)脈系統(tǒng)最終到達(dá)缺血后再灌注的肝區(qū)；植入后的240 min，外源性線粒體在受體動(dòng)物肝細(xì)胞中仍保持著完整膜電位，明顯的減輕了再灌注后的肝組織損傷，減少了氧化應(yīng)激和細(xì)胞死亡。上述研究提示，孤立的外源性線粒體植入可應(yīng)用于減少多臟器的缺血再灌注損傷；減少缺血后的再灌注損傷不僅在治療缺血性疾病中有重要的臨床治療價(jià)值，也對(duì)組織及器官移植等手術(shù)中減少機(jī)體損傷有著重要的意義。除了應(yīng)用于減少多臟器的缺血再灌注損傷外，外源性線粒體植入在精神分裂癥[22]、阿爾茲海默癥[27]、帕金森病[28]等神經(jīng)系統(tǒng)疾病動(dòng)物模型中的治療作用也得到了證實(shí)。

研究已證明植入外源性線粒體對(duì)線粒體受損的腦、心臟、肝臟和肺組織等有治療作用，以上研究均采用的是自體或同種系動(dòng)物的外源性線粒體進(jìn)行移植，而將源自不同種屬動(dòng)物的線粒體移植到受損宿主組織是否也能保持外源性線粒體的存活并起到類似的治療作用？為了解答這一問(wèn)題，2016年Huang等[29]從倉(cāng)鼠細(xì)胞系中提取出有功能的線粒體，通過(guò)腦內(nèi)或系統(tǒng)內(nèi)動(dòng)脈注射的方式將這些分離出來(lái)的外源性線粒體植入缺血的大鼠腦組織(主要是大腦皮層神經(jīng)元)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些源于倉(cāng)鼠的線粒體也能恢復(fù)腦缺血大鼠的運(yùn)動(dòng)性能，可顯著減少腦梗死區(qū)域和神經(jīng)元細(xì)胞死亡數(shù)量；該研究在腦缺血大鼠的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞中都觀察到了內(nèi)化的倉(cāng)鼠線粒體。這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)異種外源性線粒體也可以有效地對(duì)抗中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的急性缺血性損傷，同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞中分離的外源性線粒體不僅能對(duì)抗急性損傷，也能對(duì)腦組織有長(zhǎng)期保護(hù)作用。不僅來(lái)源于異種屬動(dòng)物的線粒體可以通過(guò)跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入受體細(xì)胞，從植物(如雪松等)葉子中分離出的線粒體也可以在30分鐘內(nèi)進(jìn)入人體細(xì)胞并保持有活性[28]。

關(guān)于外源性線粒體植入的途徑，在臨床上直接進(jìn)行上述的心臟注射、腦區(qū)注射或脾臟注射存在諸多風(fēng)險(xiǎn)。最近的一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明[28]，靜脈注射有活性的外源性線粒體后，小鼠的多種不同組織(如腦、肝臟、腎臟、肌肉和心臟)中均可檢測(cè)到有功能的外源性線粒體，并同樣具有治療作用。在Shi等[28]的研究中，通過(guò)靜脈注射的這些外源性線粒體不僅增加了正常的小鼠耐力，也通過(guò)增加電子傳遞鏈的活動(dòng)，減少ROS水平，防止細(xì)胞凋亡和壞死，進(jìn)而阻止了帕金森病(Parkinson's disease，PD)小鼠疾病的進(jìn)展；同時(shí)，研究還對(duì)血液中的紅細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)外源性線粒體并未進(jìn)入到成熟的紅細(xì)胞，成熟的紅細(xì)胞不具有線粒體，因而可避免在運(yùn)輸氧的過(guò)程中耗氧，因此，這種靜脈注射外源性線粒體的治療方法不會(huì)影響紅細(xì)胞運(yùn)輸氧的功能。上述研究表明通過(guò)靜脈注射進(jìn)行外源性線粒體植入可能是一種更為安全、有效且易于實(shí)施的植入方式。

3 外源性線粒體跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制

植入攜帶有線粒體的外源性細(xì)胞或者孤立的外源性線粒體，已被證實(shí)可在多種細(xì)胞自發(fā)的進(jìn)行跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)。然而，這種外源性線粒體的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制尚不明確，目前研究認(rèn)為細(xì)胞融合、各種細(xì)胞間的細(xì)胞質(zhì)橋接以及分泌囊泡外泌體等可能是其機(jī)制。

在植入攜帶外源性線粒體細(xì)胞的研究中，首先需要明確的是線粒體是以完整的線粒體形式還是mtDNA形式從植入的外源性細(xì)胞進(jìn)入受體細(xì)胞。Cho等[30]通過(guò)線粒體內(nèi)膜染料R6G對(duì)完整的外源性線粒體進(jìn)行標(biāo)記，結(jié)果表明受體細(xì)胞恢復(fù)線粒體功能是由于完整的線粒體轉(zhuǎn)移，而不僅僅是mtDNA轉(zhuǎn)移。對(duì)于其轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究，Spees等[16]將hMSCs和成纖維細(xì)胞分別與線粒體缺陷的A549細(xì)胞共孵育，為了確認(rèn)線粒體從hMSCs和成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)移到A549細(xì)胞的過(guò)程是否發(fā)生了細(xì)胞融合，分析了核DNA和mtDNA，發(fā)現(xiàn)A549細(xì)胞中出現(xiàn)了hMSCs或成纖維細(xì)胞這兩種供體細(xì)胞的mtDNA，但沒(méi)有檢測(cè)到來(lái)自供體細(xì)胞的核DNA。這項(xiàng)研究結(jié)果提示線粒體的這種細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)并不依賴于細(xì)胞融合。

隧道納米管是Rustom等在鼠嗜鉻細(xì)胞瘤(PC12)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種新的細(xì)胞間通信途徑。2004年Rustom等[31]首次描述并將這種細(xì)胞間通信途徑命名為隧道納米管(tunneling nanotubes，TNT),掃描電鏡下可見(jiàn)TNT是細(xì)胞間形成的一種膜狀細(xì)胞橋，可直接連接相鄰細(xì)胞。迄今為止，檢測(cè)到TNT的細(xì)胞類型的數(shù)量在不斷增加[32]，提示TNT可能是細(xì)胞間通信的一種普遍存在的機(jī)制。在不同類型的細(xì)胞中，TNT結(jié)構(gòu)具有多樣性，但又具有相似的特征；目前研究證實(shí)，TNT在數(shù)分鐘內(nèi)就可形成，直徑50～200納米，長(zhǎng)度可達(dá)數(shù)個(gè)細(xì)胞直徑，結(jié)構(gòu)上有纖維狀肌動(dòng)蛋白(f-actin)而無(wú)微管[31]，為一種細(xì)胞向鄰近細(xì)胞發(fā)出的突起，形態(tài)上類似于絲狀物，可在離它們最近的距離上動(dòng)態(tài)連接細(xì)胞。TNT已被證實(shí)可在細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)多種細(xì)胞成分，如轉(zhuǎn)移膜相關(guān)的細(xì)胞器、線粒體、溶酶體等[33～35]。

除了形成納米管外，分泌微泡也被認(rèn)為是線粒體跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的重要機(jī)制之一。Islam等[18]將BMSCs灌注到肺組織的研究中發(fā)現(xiàn)，健康的BMSCs在附著于損傷的肺泡上皮后，形成了納米管并釋放出了微泡，且在這種微泡中檢測(cè)到了源于BMSCs的正常線粒體，該研究認(rèn)為BMSCs釋放的微泡被上皮細(xì)胞吸收可能是導(dǎo)致線粒體跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的原因之一。

先前的研究已經(jīng)提出了隧道納米管或其他細(xì)胞間連接的參與可能是外源性線粒體細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制，然而，植入孤立外源性線粒體的相關(guān)研究并不支持隧道納米管是其進(jìn)入細(xì)胞的機(jī)制。Masuzawa等[25]在心肌細(xì)胞周圍植入自體線粒體后并沒(méi)有觀察到心肌細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞延伸，表明通過(guò)隧道納米管進(jìn)行的線粒體吸收雖然在細(xì)胞間轉(zhuǎn)移中表現(xiàn)出來(lái)，但可能不會(huì)在細(xì)胞器-細(xì)胞轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。孤立的外源線粒體被受體細(xì)胞吸收的機(jī)制可能是通過(guò)內(nèi)吞作用的途徑，2018年Robicsek等[22]對(duì)這種孤立的外源性線粒體進(jìn)入細(xì)胞的機(jī)制進(jìn)行了探討，認(rèn)為依賴于肌動(dòng)蛋白的胞飲作用是最有可能的作用方式。細(xì)胞的大胞飲是一種細(xì)胞表面進(jìn)行的內(nèi)吞活動(dòng)，可以通過(guò)吸收0.5～1 μm大小的細(xì)胞外顆粒來(lái)進(jìn)行跨細(xì)胞交流[36，37]。目前這一機(jī)制的推測(cè)尚缺乏足夠的證據(jù)，仍有待于進(jìn)一步的研究來(lái)證實(shí)。

4 外源性線粒體植入治療線粒體聾病的應(yīng)用前景

線粒體基因和功能的異?？蓪?dǎo)致多種類型的感音神經(jīng)性聾，迄今為止已有多種線粒體突變被證實(shí)是先天性聾和后天獲得性聾的致病機(jī)制[38，39]。線粒體聾病可表現(xiàn)為伴有其他臨床癥狀的綜合征型耳聾和不伴有其他任何臨床癥狀的非綜合征型耳聾。由于耳蝸細(xì)胞線粒體是藥物、缺氧、噪聲等多種有害因素攻擊的主要靶點(diǎn)之一，耳蝸細(xì)胞線粒體的功能障礙已被證實(shí)與藥物性聾、噪聲性聾等多種類型的感音神經(jīng)性聾有關(guān)[38，40]。臨床上常見(jiàn)的線粒體12SrRNA基因的A1555G突變和C1494T突變，即是氨基糖苷類抗生素致聾的常見(jiàn)病因。耳蝸細(xì)胞線粒體還與老年性聾密切相關(guān)，細(xì)胞衰老過(guò)程中mtDNA突變不斷發(fā)生和積累，目前研究已在老年性聾的動(dòng)物模型中驗(yàn)證了mtDNA缺失與年齡相關(guān)性耳聾之間具有明顯相關(guān)性[41]。

迄今為止線粒體聾病尚缺乏有效的治療方法。臨床上主要通過(guò)對(duì)遺傳性線粒體聾病患者進(jìn)行產(chǎn)前基因檢測(cè)和指導(dǎo)，避免攜帶有線粒體mtDNA致病突變的個(gè)體出生。然而，這種篩查涉及的突變位點(diǎn)有限，目前僅有C1494T突變和A1555G突變等少數(shù)線粒體突變位點(diǎn)可被檢測(cè)[42]。先天性及后天獲得性線粒體聾病一旦發(fā)生，便無(wú)法治愈，因此亟待尋找一種新的線粒體治療方法糾正耳蝸細(xì)胞的線粒體功能、治療線粒體聾病。目前外源性線粒體植入已在心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)疾病等動(dòng)物模型上證實(shí)了治療效果，如果外源性線粒體也能進(jìn)入受損的耳蝸細(xì)胞并保持活性，進(jìn)而使耳蝸細(xì)胞恢復(fù)線粒體功能，那么有望在治療線粒體聾病方面取得突破性進(jìn)展。

然而，外源性線粒體植入應(yīng)用于在體的耳蝸細(xì)胞尚存在諸多問(wèn)題，如：耳蝸位于顳骨深部，血供遠(yuǎn)不如心臟、肝臟及腦組織等豐富，通過(guò)靜脈注射途徑植入的外源性線粒體是否能夠到達(dá)耳蝸細(xì)胞周圍尚存在疑問(wèn)，因此，圓窗給藥或后半規(guī)管的局部注射可能是更適合耳蝸植入外源性線粒體的途徑。同時(shí)，植入外源性線粒體也存在潛在的風(fēng)險(xiǎn)。在前述研究中植入有活性的外源性線粒體并未發(fā)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞及機(jī)體造成負(fù)面影響，但植入的線粒體一旦失活則會(huì)引發(fā)機(jī)體的炎性損傷。2016年Wilkins等[43]將孤立的線粒體及分離出的線粒體DNA進(jìn)行冰凍滅活，隨后通過(guò)注射植入到C57BL/6小鼠的海馬體內(nèi)，7天后在海馬體檢測(cè)到了大量炎性標(biāo)記物，研究發(fā)現(xiàn)這些失活的線粒體或線粒體成分可誘發(fā)神經(jīng)炎癥；因此，保證植入線粒體的完整性和活性十分關(guān)鍵。

盡管存在諸多風(fēng)險(xiǎn)和困難，外源性線粒體植入仍為線粒體病的治愈提供了一種新的獨(dú)特的治療策略，可從根本上糾正線粒體的遺傳異常和功能缺陷，有望成為一種新的有效的治療手段，與其他臨床干預(yù)措施相結(jié)合或單獨(dú)應(yīng)用于線粒體聾病的治療。