蔡曉鋒, 郁征宇, 王小麗, 徐晨曦, 葛晨輝, 王 水, 王全華

(上海師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 植物種質(zhì)資源開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心,上海 200234)

菠菜(SpinaciaoleraceaL.)屬于莧科菠菜屬植物[1],是一種重要的深綠色葉用蔬菜,具有很高的營養(yǎng)價(jià)值,并逐漸被列入健康飲食菜單[2].菠菜適應(yīng)性強(qiáng),栽培廣泛,是上海市民餐桌上最常見的綠葉菜類蔬菜之一,也是補(bǔ)充上海市蔬菜市場淡季的主要綠葉菜品種之一.上海地區(qū)菠菜栽培多為設(shè)施大棚栽培,且栽培密度高,在春初和秋冬栽培過程中低溫高濕、種植密度大等因素經(jīng)常導(dǎo)致菠菜霜霉病爆發(fā),給種植者造成重大的損失.菠菜霜霉病(Peronosporafarinosaf.sp.Spinaciae,Pfs)是由專性寄生菌引起的氣傳真菌病害[3],主要危害植株葉片,苗期和成株期均可發(fā)生,嚴(yán)重影響菠菜的產(chǎn)量和品質(zhì),降低經(jīng)濟(jì)效益.菠菜霜霉病菌是專性寄生真菌,不同地區(qū)存在著生理小種分化現(xiàn)象.菠菜霜霉病菌首次報(bào)道于1800年,但直到1991年才鑒定出4個(gè)菠菜霜霉病菌生理小種[4];而在接下來的20年間鑒定出10個(gè)霜霉病菌生理小種[5-6].到目前為止,已經(jīng)分離鑒定出16個(gè)菠菜霜霉病菌生理小種[2,7].Irish等[5-6]建立了菠菜霜霉病菌生理小種鑒定的標(biāo)準(zhǔn)方法和鑒別寄主.菠菜霜霉病菌鑒別寄主含有不同的抗性位點(diǎn),因此可以對(duì)菠菜霜霉病菌以及新的生理小種進(jìn)行鑒定分析,為針對(duì)不同地區(qū)不同生理小種進(jìn)行有目的的抗病育種工作奠定了基礎(chǔ).目前美國、日本和歐洲各國的菠菜霜霉病菌生理小種陸續(xù)被鑒定出來,而中國菠菜霜霉病菌生理小種鑒定還剛剛起步.范桂彥等[8]利用10個(gè)菠菜霜霉病菌鑒別寄主鑒定了北京、山東和山西的5個(gè)菠菜霜霉病菌生理小種,結(jié)果表明北京的霜霉病菌樣品為9號(hào)生理小種,山東霜霉病菌樣品為8號(hào)生理小種,山西霜霉病菌樣品為5號(hào)生理小種.

真菌的分類鑒定主要以真菌的形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)手段進(jìn)行,核糖rDNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列分析技術(shù)是常用的分子生物學(xué)方法.利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增病原菌核糖體ITS基因區(qū)段進(jìn)行真菌鑒定、檢測及病害診斷的方法因其快速、準(zhǔn)確、簡便而得到迅速發(fā)展.目前只有新疆地區(qū)利用ITS技術(shù)快速檢測出菠菜霜霉病菌[9].本研究基于菠菜霜霉病菌生理小種鑒別寄主系統(tǒng),對(duì)采集自上海地區(qū)的菠菜霜霉病菌生理小種進(jìn)行鑒定;利用ITS通用引物擴(kuò)增ITS序列,并對(duì)ITS序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析,以期明確該區(qū)域生理小種分化,為菠菜抗霜霉病育種提供參考.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菠菜霜霉病菌生理小種鑒別寄主為9份菠菜栽培品種,由美國阿肯色大學(xué)提供.參試的菠菜霜霉病菌樣品共2份,分別采集于上海地區(qū)2017年春季和秋季發(fā)病設(shè)施大棚內(nèi),采集后的新鮮帶菌葉片和正常葉片直接放入保鮮袋中,于-20 ℃低溫保存?zhèn)溆?使用前接種于感病菠菜材料上.

1.2 接種方法及鑒定

2017年11月,將9份鑒別寄主播種于上海師范大學(xué)奉賢校區(qū)生物基地的玻璃溫室中,穴盤育苗,在植株長出3～5片真葉時(shí)定植于培養(yǎng)槽和營養(yǎng)缽中,分別種植于玻璃溫室和人工氣候室,參考文獻(xiàn)[10]的方法進(jìn)行菠菜霜霉病菌接種.用毛刷將霜霉病菌從感病菠菜葉片上刷下,制成孢子懸浮液,孢子濃度約為105mL-1,用噴壺均勻地噴于鑒別寄主植株葉片上,以噴清水的葉片作對(duì)照,每份鑒別寄主接種10株,重復(fù)3次.接種后,先將植株在溫度18 ℃、濕度96%條件下保濕24 h;然后置于溫度18～20 ℃、濕度75%、光照強(qiáng)度8500 lx 條件的人工氣候室中光照生長12 h;玻璃溫室培養(yǎng)槽中連續(xù)噴施3～5 d,噴施后封閉溫室,保持濕度在50%～60%范圍內(nèi).

根據(jù)菠菜植株葉片上霜霉病的發(fā)病情況統(tǒng)計(jì)每個(gè)鑒別寄主的抗感狀況,植株葉片上有明顯可見的白色霜霉病菌或灰色霜霉層或淡黃色感病病斑者為感病菠菜,植株葉片無上述癥狀者為抗病菠菜.鑒別寄主植株發(fā)病率<15%即為抗病,>85%即為感病,在15%～85%之間則說明該病樣為混合生理小種[10].根據(jù)霜霉病菌在9份鑒別寄主上的抗、感反應(yīng)確定生理小種.

1.3 序列擴(kuò)增、克隆及測序

利用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取菠菜霜霉病感病和正常葉片基因組DNA,使用分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測核酸的濃度和質(zhì)量.采用真菌核糖ITS區(qū)通用引物ITS1/ITS4對(duì)提取的核酸進(jìn)行擴(kuò)增,引物序列如下:

ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCG-3′;ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′.

PCR反應(yīng)體系總體積為15 μL,包含1×10緩沖液(含Mg2+)1.5 μL,物質(zhì)量濃度為10 μmol·L-1的正反向引物各0.3 μL,物質(zhì)的量濃度為0.25μmol·L-1的三磷酸堿基脫氧核苷酸(dNTPs)0.3 μL,生物量濃度為0.05 U·μL-1的水生棲熱菌(Taq)DNA聚合酶 0.1 μL,模板DNA 1 μL,雙蒸水11.5 μL.PCR程序?yàn)?在94 ℃溫度下預(yù)變性5 min,在94 ℃溫度下變性30 s,在56 ℃溫度下退火30 s,在72 ℃溫度下延伸45 s,共進(jìn)行35個(gè)循環(huán),再在72 ℃溫度下延伸10 min.將PCR產(chǎn)物在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的瓊脂糖凝膠,1×TAE電泳緩沖液,100 V電壓條件下電泳30 min,置凝膠成像系統(tǒng)中觀察分析.將PCR產(chǎn)物與pEASY-Blunt載體連接,然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)過挑菌和M13通用引物PCR檢測后送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序.

1.4 序列生物信息學(xué)分析

利用Multalin(http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/)和Geneious進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析多重序列比對(duì)[11];利用MEGA4軟件構(gòu)建鄰近法(NJ)系統(tǒng)進(jìn)化樹[12],參數(shù)為軟件默認(rèn)值:泊松校正、隨機(jī)種子系統(tǒng)測驗(yàn)和成對(duì)刪除[13].采用重復(fù)1000次的自舉法檢驗(yàn)構(gòu)建進(jìn)化樹的可靠性,自舉率大于50%的分支被認(rèn)為是可靠的結(jié)果,并生成對(duì)應(yīng)的圖片格式.

2 結(jié)果與分析

2.1 菠菜霜霉病菌生理小種鑒定

在人工氣候室進(jìn)行霜霉病菌生理小種接種5 d后,試樣開始陸續(xù)出現(xiàn)發(fā)病現(xiàn)象,8 d后不再出現(xiàn)新的發(fā)病癥狀,結(jié)束試驗(yàn)并統(tǒng)計(jì)發(fā)病狀況,劃分反應(yīng)類型;在玻璃溫室進(jìn)行霜霉病菌生理小種接種的試樣,于23 d后開始出現(xiàn)發(fā)病現(xiàn)象,35 d后不再出現(xiàn)新的發(fā)病癥狀,結(jié)束試驗(yàn)并統(tǒng)計(jì)發(fā)病狀況,劃分反應(yīng)類型.結(jié)果表明:玻璃溫室接種試樣抗病性鑒定結(jié)果和人工氣候室的鑒定結(jié)果一致,但發(fā)病情況輕于室內(nèi)接種鑒定結(jié)果.結(jié)合菠菜霜霉病菌生理小種鑒別系統(tǒng)(表1)[5-6]對(duì)2份樣品進(jìn)行鑒定,結(jié)果表明,采自上海的2份菠菜霜霉病菌樣品(SH-1、SH-2)均為9號(hào)生理小種(表2).

表1 菠菜霜霉病菌生理小種鑒別系統(tǒng)

注:+ 代表感病反應(yīng),- 代表抗病反應(yīng),下同

表2 菠菜霜霉病菌生理小種鑒別結(jié)果

2.2 ITS序列克隆及測序

采用ITS1和ITS4通用引物分別對(duì)菠菜正常葉片和霜霉病感病葉片的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物用1.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠做電泳檢測.結(jié)果表明,在菠菜霜霉病感病葉片中可以擴(kuò)增出2條條帶,分別為700 bp和900 bp左右的條帶,同樣在菠菜霜霉病感病植株附近的正常抗病菠菜葉片中也可以分別擴(kuò)增出700 bp和900 bp左右的條帶,而在人工氣候室的正常菠菜葉片中可以擴(kuò)增出一條700 bp左右的條帶(圖1).

將菠菜霜霉病感病葉片中擴(kuò)增的2條條帶分別回收,然后連接pEASY-Blunt載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌,菌液PCR檢測結(jié)果表明在重組質(zhì)粒菌液中可以分別擴(kuò)增出900 bp和1100 bp左右的條帶(利用載體上M13測序引物擴(kuò)增,包括載體片段200 bp)(圖2),將PCR陽性菌液送去測序.

圖1 ITS1/ITS4引物擴(kuò)增結(jié)果(M為Trans2K Plus DNA Marker;1～5為菠菜霜霉病感病植株葉片DNA;7～8為菠菜霜霉病感病植株附近的抗病植株葉片DNA;9～12為在人工氣候室培養(yǎng)的正常菠菜葉片DNA)

圖2 菠菜霜霉病菌重組質(zhì)粒PCR檢測結(jié)果(M為Trans2K Plus DNA Marker;3～17為900 bp片段重組質(zhì)粒菌液PCR檢測結(jié)果;1～2為700 bp片段重組質(zhì)粒菌液PCR檢測結(jié)果)

2.3 ITS序列生物信息學(xué)分析

測序結(jié)果表明900 bp左右的條帶實(shí)際大小為887 bp,700 bp左右的條帶實(shí)際大小為739 bp.在美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)進(jìn)行BLAST比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)887 bp條帶為霜霉病病原菌ITS序列,并命名為PFS-SP,739 bp的條帶為菠菜熱激轉(zhuǎn)錄因子.將PFS-SP序列和21條從NCBI上下載的其他霜霉病病原菌ITS序列進(jìn)行相似性比較,發(fā)現(xiàn)上海菠菜霜霉病病原菌ITS序列PFS-SP與Peronosporaeffusa(AF528560.1)相似性最高,為99.4%.多重序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果表明PFS-SP與Peronosporaeffusa具有很高的同源性,與Peronosporafarinosa(FM863725.2)、Peronosporarumicis(AF465758.1)和Peronosporaboni-henrici(FM863712.2和FM863714.2)具有較高的同源性,并聚在同一個(gè)分支(圖3).

圖3 根據(jù)ITS基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié) 論

采集了上海的2份菠菜霜霉病菌生理小種,經(jīng)過鑒定均屬于9號(hào)生理小種,與范桂彥等[8]鑒定的來自于北京的3份霜霉病病樣相同.由于菠菜霜霉病病原菌可以通過種子傳播,而我國的菠菜生產(chǎn)中國外種子的使用比例很高,這很有可能是9號(hào)生理小種在北京和上海均有發(fā)現(xiàn)的原因.利用ITS通用引物ITS1/ITS4在菠菜霜霉病感病葉片DNA中擴(kuò)增出887 bp的條帶,序列分析表明其屬于菠菜霜霉病屬(Peronosporaeffusa),與NCBI中已有的序列AF528560.1具有很高的相似性.此外利用通用引物ITS1/ITS4還可以實(shí)現(xiàn)快速對(duì)菠菜霜霉病樣品的檢測.