王祖文,黃光智，丁曉雯*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，食品科學(xué)與工程國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，重慶，400716) 2(西南大學(xué) 科技處，重慶，400716)

丙烯酰胺(acrylamide,AA)是一種無色無味的有機(jī)小分子化合物，在常溫常壓下多以固體形式存在，具有結(jié)晶性，分子量低，可溶于水、乙醇、丙酮，不易揮發(fā)，對光線敏感，在紫外線作用下易發(fā)生聚合形成聚丙烯酰胺[1-2]。AA在1994年被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)劃分為“人類可能致癌物”(2A類)[3]，對動物具有致癌、生殖毒性、遺傳毒性[4]等多種作用，對人的神經(jīng)毒性[5-6]也得到證實(shí)。油炸及焙烤的淀粉類等經(jīng)高溫加工的食品中存在含量不等的AA，在一定的溫度范圍內(nèi)其含量隨著加工溫度的升高而增加[7]，例如油炸薯片、餅干、面包等熏烤制品都可能存在較大量的AA，對人類健康存在潛在的危害。食品中AA含量的波動性很大，根據(jù)歐洲食品安全局(EFSA)對不同食品中AA的監(jiān)測報(bào)告顯示，食品中AA的平均含量在31μg/kg(嬰幼兒加工谷物食品)～1 350μg/kg(咖啡替代品)范圍內(nèi)[8]。據(jù)報(bào)道，對于神經(jīng)毒性的AA每日可耐受攝入量(TDI)為40mg/(kg·d)，致癌的TDI為2.6mg/(kg·d)[9]，因此，為了消費(fèi)者的健康應(yīng)加強(qiáng)食品中AA的監(jiān)控。

近幾年來，對AA的檢測方法有很大發(fā)展，除了常規(guī)的氣相、液相及其聯(lián)用技術(shù)外，新型的檢測技術(shù)如基于褐變的快速測定、毛細(xì)管電泳、酶聯(lián)免疫分析技術(shù)、生物傳感器及熒光傳感等也得到了發(fā)展(表1)。本文就AA各檢測方法的優(yōu)缺點(diǎn)及在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用進(jìn)行綜述比較，為開發(fā)簡單、便捷、快速的檢測方法提供新思路。

1 AA常規(guī)檢測技術(shù)

1.1 氣相色譜(gas chromatography，GC)及其聯(lián)用技術(shù)

基于GC分離的檢測方法被廣泛用于測定多種食品體系中的AA。因AA高極性和低揮發(fā)性，必須對其衍生化來改善穩(wěn)定性和揮發(fā)性，提高檢測靈敏度。我國現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中氣相-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)采用穩(wěn)定性同位素稀釋技術(shù)檢測食品AA，在試樣中加入13C3-AA內(nèi)標(biāo)液，水作提取劑得到試樣提取液，在基質(zhì)固相分散萃取凈化、溴試劑衍生后，用GC-MS/MS的多反應(yīng)離子監(jiān)測(multiple reaction monitoring, MRM)或GC-MS的選擇離子監(jiān)測(single ion monitor, SIM)進(jìn)行檢測。該方法的定量限為10 μg/kg[10]。一些新的衍生技術(shù)如呫噸氫醇作為衍生劑用于AA衍生，該方法適用于食品和水體系，所需反應(yīng)條件溫和，同時避免了不穩(wěn)定的溴化衍生物的產(chǎn)生[11-12]。LUO等[13]建立了用呫噸氫醇衍生、穩(wěn)定性同位素稀釋的GC-MS測定煎炸、烘焙食品中AA含量的方法。該方法在試樣中加入d3-AA，經(jīng)提取凈化，用呫噸氫醇做衍生試劑，GC-MS檢測，其檢出限(LOD)為0.7 μg/kg(S/N=3)，線性范圍為0.005～4 μg/mL，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于6.1%，樣品加標(biāo)回收率在95%～112%。該方法具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，具有較高的應(yīng)用價值。

1.2 液相色譜(liquid chromatography，LC)及其聯(lián)用技術(shù)

AA是強(qiáng)極性分子，在傳統(tǒng)反相吸附劑中的保留值低，導(dǎo)致基質(zhì)中AA和其他的萃取物在LC中分離效果差。因此，在傳統(tǒng)反相吸附柱中，LC與紫外檢測器或二極管陣列檢測器結(jié)合的選擇性低，僅適用于檢測AA含量高[14]，如炸薯?xiàng)l等加工食品。GB/T 5009.204—2014采用穩(wěn)定性同位素稀釋技術(shù)，以13C3標(biāo)記的AA為內(nèi)標(biāo)溶液，水溶劑提取萃凈化后，用LC-MS/MS進(jìn)行檢測[10]。陳子亮等[15]采用QuEChERS替代傳統(tǒng)的固相萃取柱進(jìn)行前處理，結(jié)合UHLC-MS/MS測定油炸食品中的AA。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)AA濃度為1～1 000 μg/kg時，線性關(guān)系良好(r2=0.999)，LOD為5 μg/kg(S/N=3)，加標(biāo)回收率為60.2%～108.3%，RSD為1.6%～16.8%。PAOLA等[16]采用QuEChERS-LC-MS測定干果和可食用種子的AA含量，AA在較低濃度(5～25 μg/kg)時RSD為20%，較高濃度(26～124 μg/kg)時RSD為10%。此方法樣品的前處理簡單快速、靈敏度高、再現(xiàn)性好，能滿足實(shí)際工作檢測油炸食品中AA的需要。

2 AA新型檢測技術(shù)

雖然上述標(biāo)準(zhǔn)方法具有靈敏度高、特異性好、可重復(fù)等優(yōu)點(diǎn)，但對分析物進(jìn)行萃取、衍生、凈化衍生物等一系列步驟，操作復(fù)雜，相對費(fèi)時，不適宜大批量樣本的檢測，對大型儀器的需求以及操作人員技術(shù)的要求也限制了該方法的使用。因此一些簡單、便攜、快速的檢測方法如基于褐變的快速測定方法、酶聯(lián)免疫吸附分析方法、生物傳感法及熒光傳感法等被相繼提出并用于食品中AA含量的檢測。

2.1 基于褐變的快速測定方法

美拉德反應(yīng)中還原糖和天冬酰胺反應(yīng)生成AA的同時伴隨著顏色的變化，研究表明，褐變程度與食品中生成的AA濃度有一定的關(guān)系[17]。G?KMEN等早期采用L*a*b*體系測定食品發(fā)生美拉德反應(yīng)的顏色變化[18]，隨后發(fā)現(xiàn)食品在加熱過程中參數(shù)a*的變化與AA含量有關(guān)[19],但是該單一指標(biāo)不能準(zhǔn)確地評估表面不均勻的食品中AA的含量。G?KMEN等又提出采用機(jī)器視覺法，通過建立褐變比率與AA濃度之間的關(guān)系來定量分析食品中的AA含量[20-21]。這種基于褐變的檢測方法快速、簡單、易操作、且無需對樣品進(jìn)行前處理，但因受光強(qiáng)、焦距、光圈等因素影響[22]，準(zhǔn)確性較差，因此該方法僅適用于食品中AA含量的粗略估計(jì)。

2.2 毛細(xì)管電泳法(capillary electrophoresis，CE)

因CE分離效率和速度高，對樣品和試劑量需求少，被認(rèn)為是食品科學(xué)非常有用的分析工具[23]。CE是基于目標(biāo)物荷質(zhì)比的不同而實(shí)現(xiàn)高效分離的分析方法，可用于檢測食品中AA含量[24]。分離物必須帶電是分離的前提，但AA不帶電荷，要在電場條件下實(shí)現(xiàn)分離，必須使其具備電荷。ZHOU等[25]首次建立了毛細(xì)血管膠束電動色譜(micellar electrokinetic capillary chromatography，MEKC)，在緩沖液中加入離子型的表面活性劑，使其包裹AA形成帶電的膠束，通過檢測該膠束實(shí)現(xiàn)AA的定量檢測。BERMUDO等[26]建立了毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)，通過柱前衍生使AA帶電，在高壓直流電場驅(qū)動下實(shí)現(xiàn)分離。BERMUDO等用2-巰基苯甲酸(2-MBA)將樣品中的AA衍生化，然后采用兩種在線富集模式(場放大進(jìn)樣(FASS)和大體積樣品堆積(LVSS))的CZE與MS/MS相結(jié)合分析檢測衍生后的AA，其檢測結(jié)果與色譜法相比具有可比的靈敏度和精確度，可用于餅干、谷物、脆面包和咖啡等食品AA含量的分析[26-27]。此外，可將AA在低pH非水有機(jī)相(如乙腈)中進(jìn)行質(zhì)子化而帶電，從而能在電場的作用下移動[28]。TEZCAN等[28]將FASS引入非水毛細(xì)管電泳法(nonaqueous capillary electrophoresis，NACE)中，在線濃縮AA，進(jìn)一步提高了210 nm處在線紫外檢測AA的靈敏度，方法的LOD值分別降至2.6 ng/mL(電動注射)和4.4 ng/mL(水動力注射)，可以快速和經(jīng)濟(jì)地比較不同食品加工AA的含量。EL-HADY等[29]首次采用基于離子液體的毛細(xì)管電泳(analyte focusing by ionic liquid micelle collapse capillary electrophoresis，AFILMC)測定AA，在0.05～10.0 μmol/L濃度范圍內(nèi)，LOD為0.71 ng/g，RSD為1.14%～3.42%(n=15)，回收率為98.0%～110.0%，該方法可對面包等食品中AA進(jìn)行高效檢測。

微芯片電泳方法(microchip electrophoresis, MCE)被認(rèn)為是可以成功替代CE的方法，MCE除了具有CE的優(yōu)點(diǎn)外，其所需的分析儀器可更小型化，注射樣品時間短，進(jìn)樣量少，分離通道更短可實(shí)現(xiàn)更快速的分離，靈敏度高[30]。但檢測食品樣品中低豐度的AA，其檢測限不適用，而在線富集技術(shù)提高了MCE的靈敏度[30-31]。WU等[32]采用在線多重富集技術(shù)，結(jié)合FASS和反向堆積的MCE分析薯片和薯?xiàng)l的AA，其LOD為1 ng/mL，RSD為2.4%～7.5%，回收率在94.7%～110.7%，其檢測靈敏度與在線富集技術(shù)的CE方法相當(dāng)，比未采用富集技術(shù)的CE方法提高了41～70倍，且真實(shí)食品的基質(zhì)對AA的定量沒有干擾。

2.3 酶聯(lián)免疫分析法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)

ELISA是一種基于抗原與抗體的高特異結(jié)合，通過檢測酶催化底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)快速、簡單地分析目標(biāo)物的方法，已廣泛用于食品檢測領(lǐng)域。AA是小分子，缺少抗原決定簇和免疫原性，因此常將AA與具有免疫應(yīng)答的載體蛋白進(jìn)行交聯(lián)制備完全抗原，刺激動物產(chǎn)生免疫反應(yīng)生成AA的血清，經(jīng)純化后得到AA抗體。如付云潔[33]等采用戊二醛法合成丙烯酰胺-牛血清白蛋白(AA-BSA)免疫抗原，注入兔體內(nèi)產(chǎn)生抗AA多克隆抗體。該檢測方法準(zhǔn)確快速、特異性強(qiáng)，適用于熱加工食品中AA的快速檢測，但可能反應(yīng)效率低、易丟失抗原決定簇[34]。此外，使用活性酯如1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二甲胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)結(jié)合AA或AA類似物和載體蛋白進(jìn)行交聯(lián)可制備完全抗原。一些研究結(jié)果表明，在進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)時，需先將AA衍生化以增加AA與載體蛋白之間連接分子的長度，使AA基團(tuán)暴露，才能有效刺激動物產(chǎn)生抗AA或其衍生物的血清[35]。如PRESTON等[35]用3-巰基苯甲酸(3-MBA)衍生化的AA作為半抗原與載體蛋白交聯(lián)制備完全抗原，免疫反應(yīng)后得到AA衍生物的多克隆抗體。WANG[36]和WU等[37]也做過類似的研究，但是EDC/NHS交聯(lián)法較為復(fù)雜，且會產(chǎn)生副產(chǎn)物，在實(shí)際檢測AA時需現(xiàn)將其衍生化，這也增加了檢測的時間和成本。

許多研究都是基于多克隆抗體ELISA試劑盒檢測食品中的AA。但多克隆抗體是不穩(wěn)定的，批次之間存在差異，可能產(chǎn)生大量的非特異性抗體[38]。因此ZHU[38]開發(fā)了一種基于單克隆抗體(MAb)檢測AA的ELISA方法，用4-巰基苯甲酸(4-MBA)衍生化AA得到AA-4-MBA，用牛血清白蛋白(BAS)和卵清蛋白(OVA)作為載體，制備AA-4-MBA-BSA和AA-4-MBA-OVA，將其作為免疫原和包被抗原，建立了間接競爭酶聯(lián)免疫吸附法(indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay，icELISA)，IC50為32 ng/mL，LOD為8.87 ng/mL，檢測定量的范圍為8.87～112.92 ng/mL(IC20-IC80)，該法具有使用量大、通量大、分析時間短等優(yōu)點(diǎn)。鑒于實(shí)驗(yàn)需要動物產(chǎn)生抗體，商業(yè)成本高，因此對ELISA是一個挑戰(zhàn)性的問題，SUN等[39]開發(fā)了一種仿生酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(BELISA)，將親水印跡膜作為仿生抗體，直接將其在液體環(huán)境中聚合于MaxiSorp聚苯乙烯96孔板上，該印跡膜對AA具有較高的結(jié)合能力和特異性，在不失靈敏度的情況下可重復(fù)使用20次，使得分析成本大大降低。且BELISA有較好的靈敏度(IC50，(8±0.4)mg/L)和較好的檢出限(IC15，(85±4.2)μg/L)，具有較高的回收率。

總體來講，相比傳統(tǒng)的檢測方法，ELISA法盡管在檢測的靈敏度上沒有優(yōu)勢，但其分析速度快，且不需要昂貴的儀器與復(fù)雜的樣品前處理過程，對ELISA試劑盒的開發(fā)有不錯的市場前景。

2.4 生物傳感法

目前，一些研究集中于用血紅蛋白(Hb)修飾的電極測定食品中的AA。AA可以和Hb結(jié)構(gòu)中纈氨酸的α-NH2結(jié)合形成加合物，可作為感應(yīng)器檢測AA的含量[42]。Hb將生物傳感器與電化學(xué)分析結(jié)合起來,具有靈敏度高、選擇性好、響應(yīng)迅速等特點(diǎn),已廣泛應(yīng)用到分析檢測中。STOBIECKA等[43]在此基礎(chǔ)上改進(jìn)了方法，將Hb和表面活性劑(DDAB)結(jié)合形成DDAB-Hb混合物，將其結(jié)合到生物傳感器表面，AA與Hb反應(yīng)時，其產(chǎn)物促進(jìn)電極表面的電子轉(zhuǎn)移，改變Hb的血紅素Fe3+氧化還原性質(zhì)，隨著AA增加，Hb-Fe3+/Hb-Fe2+氧化還原的電流峰值的下降作為分析信號，可對檢測液中AA定性定量分析，其LOD為1.2×10-10mol/L，可直接用于薯片等食品中AA含量測定，樣品制備簡單，不受基質(zhì)的影響。

納米材料的應(yīng)用不僅可增加Hb在電極上的固定量，保持Hb的生物活性，還可通過增加電子轉(zhuǎn)移速率來提高傳感器的靈敏度[44]。KRAJEWSKA[45]等采用Hb涂覆和單壁碳納米管(SWCNTs)修飾的玻碳電極(GCE)的伏安電化學(xué)生物傳感器用于食品提取液中AA的檢測。結(jié)果表明，薯片樣品基質(zhì)組分不會影響電極的敏感性，且在該條件下，方波伏安法(OSWV)要比循環(huán)伏安法(CV)的靈敏度更高，其LOD低至1.0×10-9mol/L。多壁碳納米管(MWCNTs)是一種新型納米材料，可顯著提高電子轉(zhuǎn)移速率，提高傳感器的靈敏度。費(fèi)永樂[46]將MWCNTs/Hb/(殼聚糖)Ch修飾的生物傳感器用于油炸食品中AA的檢測，利用差分伏安脈沖法對油炸食品中AA進(jìn)行定量分析，與HPLC相比，該法具有簡便、快速、準(zhǔn)確、樣品預(yù)處理簡單、無需衍生化等優(yōu)點(diǎn)。VARMIRA等[47]建立Hb-DDAB/PtAuPd納米顆粒/Ch-IL/MWCNTs-IL/GCE的生物傳感器，采用SWV測定AA，其LOD為1.0×10-13mol/L，RSD為2.9%～3.8%。后來該團(tuán)隊(duì)用此方法和GC-MS分別測定了炸薯?xiàng)l和加標(biāo)樣品的AA，回收率在100%左右，其精密度接近GC-MS，證實(shí)了生物傳感器在實(shí)際基質(zhì)中用于AA測定的可行性。

由此可見，生物傳感技術(shù)具有選擇性，靈敏度高、重現(xiàn)性好，基本不受食品體系中其他成分的干擾等特點(diǎn)，很適合測定食品AA含量。

2.5 熒光傳感法

表1 不同檢測AA方法在食品中的應(yīng)用Table 1 Application of Analytical methods for detecting AA in food

注：“-”代表數(shù)據(jù)不存在。

3 總結(jié)與展望

標(biāo)準(zhǔn)方法適用于絕大多數(shù)食品(如薯片、咖啡、谷物類等)中AA的檢測，靈敏度雖好，但操作繁雜費(fèi)時，適用于小樣本檢測。而對于新型的檢測技術(shù)，大多以薯片作為檢測對象來判定快速檢測方法的實(shí)用性，雖快速、實(shí)效但也面臨著挑戰(zhàn)，未來需要進(jìn)一步改進(jìn)。

對現(xiàn)有的CE和基于褐變的快速測定方法，其應(yīng)用具有局限性，而MCE采用芯片技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了分析儀器的便攜化。對ELISA而言獲得高特異性的生物識別元件，簡化預(yù)處理過程及提高靈敏度，是其在線和實(shí)時檢測食品中AA的關(guān)鍵問題。設(shè)計(jì)一個適合的半抗原結(jié)合AA，并在預(yù)處理期間不需要衍生化是ELISA亟待解決的問題。此外，篩選其他類型的生物受體，如對AA具有高親和力和特異性的適配體或肽，可能為解決快速檢測中識別AA的問題提供新的方法。對于生物傳感法，其樣品前處理步驟較ELISA相對復(fù)雜，但仍比標(biāo)準(zhǔn)方法簡單，對Hb或其他生物受體在工作電極上的有效固定以及多樣性和便攜性的改進(jìn)是檢測AA的兩個挑戰(zhàn)。納米材料如金屬納米粒子(Pt、Au、Pd等)、半導(dǎo)體納米晶體(ZnO、CdSe等)、碳納米材料(碳納米管、石墨烯等)及其配合物與聚合物都是不錯的選擇，不僅能提高固定效率，也提高了檢測的靈敏度、穩(wěn)定性和多樣性。對于熒光傳感方法，目前研究較少，基于化學(xué)反應(yīng)的低靈敏度和選擇性是進(jìn)一步研究中改進(jìn)的兩個關(guān)鍵點(diǎn)。

綜上所述，已有的檢測食品中AA的方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。雖然與傳統(tǒng)方法相比，快速檢測方法具有簡單、便攜、易操作、成本低等特點(diǎn)，但是這些方法需要進(jìn)一步地提高精密度和準(zhǔn)確度，簡化檢測和樣品前處理步驟，以滿足快速、實(shí)時檢測食品中的AA含量的需求。