李國輝,劉兆平,仇凱,吳剛,黃文,隋海霞*,鐘其頂*

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京，100015) 2(全國發(fā)酵食品標(biāo)準(zhǔn)化中心，北京，100015) 3(國家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評估中心，北京，100022)

食品用金屬罐作為一種常用的食品包裝材料，其內(nèi)壁通常使用環(huán)氧酚醛、有機(jī)溶膠等涂料來增加容器耐腐蝕性和食品儲(chǔ)存時(shí)間[1-2]。近年來，相關(guān)研究表明食品用金屬罐在高溫殺菌、高溫運(yùn)輸、貨架存放等過程中內(nèi)壁涂層中的游離酚等污染物會(huì)向所接觸的食品或食品模擬物發(fā)生遷移[3-5]。相關(guān)研究表明苯酚可影響人和動(dòng)物肝臟、腎臟功能；而雙酚A可導(dǎo)致內(nèi)分泌失調(diào)，引發(fā)癌癥和肥胖；4-叔丁基苯酚、間甲基苯酚和鄰甲基苯酚可抑制人類和動(dòng)物的中樞神經(jīng)，影響呼吸系統(tǒng)、皮膚以及視力，過量的游離酚不僅能造成人類和動(dòng)物的內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)異常，還會(huì)嚴(yán)重干擾人類和動(dòng)物的生殖和遺傳功能[4-6]。因此，除總游離酚外，還應(yīng)關(guān)注單個(gè)具體游離酚的風(fēng)險(xiǎn)情況。

我國GB9685—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品接觸材料及制品用添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[7]規(guī)定苯酚的特定遷移限量(specificmigrationlimit,SML)小于3mg/kg，4-叔丁基苯酚的SML小于0.05mg/kg，雙酚A的SML小于0.6mg/L，間甲基苯酚和鄰甲基苯酚按生產(chǎn)需要適量添加。GB4806.10—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品接觸用涂料及涂層》[10]中同樣規(guī)定食品接觸用涂料及涂層中游離酚的SML為3mg/kg(以苯酚計(jì))。此外，隨著GB31604.1—2015《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品接觸材料及制品遷移試驗(yàn)通則》[9]的實(shí)施，更加苛刻的遷移條件可能使金屬罐中游離酚遷移量存在超標(biāo)的風(fēng)險(xiǎn)。另外，歐盟(EU)法規(guī)No.213/2018[8]下調(diào)了塑料中雙酚A的SML，由原來的0.6mg/kg下調(diào)為0.05mg/kg，同時(shí)規(guī)定使用含有清漆和涂層材料的包裝材料包裝的嬰幼兒配方食品、較大嬰兒配方食品、加工谷類食品、嬰兒食品、為滿足嬰幼兒營養(yǎng)需求的特殊醫(yī)療用途食品、幼兒乳基飲料或類似產(chǎn)品均不得檢出雙酚A。我國是否需要修訂雙酚A的遷移限量標(biāo)準(zhǔn)，以及遷移試驗(yàn)通則實(shí)施后，食品用金屬罐中雙酚A和其他游離酚的合規(guī)性及潛在風(fēng)險(xiǎn)，均需要對遷移量檢測分析后進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估。

目前，上述游離酚的檢測方法中僅苯酚和雙酚A有國家標(biāo)準(zhǔn)，其他種類的游離酚也可能存在一定的食品安全風(fēng)險(xiǎn)。國內(nèi)關(guān)于食品用金屬罐中除苯酚、雙酚A之外其他游離酚的分析方法以及食品用金屬罐中游離酚的風(fēng)險(xiǎn)調(diào)查鮮有報(bào)道。目前，游離酚的檢測方法主要有滴定法[11]、高效液相色譜法[12-13]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[3, 14]和氣相質(zhì)譜法[15]等。本文基于游離酚和雙酚A的國家標(biāo)準(zhǔn)測定方法，建立了針對游離苯酚、間甲基苯酚、鄰甲基苯酚、雙酚A、4-叔丁基苯酚等5種游離酚的超高效液相色譜法。應(yīng)用此方法對食品用金屬罐在特定遷移條件下的5種游離酚的遷移風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行了系統(tǒng)分析，研究結(jié)果對游離酚的監(jiān)管、標(biāo)準(zhǔn)修訂與風(fēng)險(xiǎn)評估具有借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苯酚、4-叔丁基苯酚、雙酚A、間甲基苯酚、鄰甲基苯酚：純度≥99%，德國Sigma-Aldrich公司；甲醇、乙腈：色譜純，德國Meck公司；乙酸、乙醇、正己烷：分析純，北京試劑公司；49種食品用金屬空罐來源于相關(guān)應(yīng)用企業(yè)和生產(chǎn)企業(yè)。

Agilent 1290 Infinity超高效液相色譜(附熒光檢測器)，美國Agilent公司；AL204型電子天平：(萬分之一)，梅特勒一托利多儀器廠；YXQ-LS-50A全自動(dòng)立式電熱壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；封罐機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

依據(jù)GB 5009.156—2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品接觸材料及制品遷移試驗(yàn)預(yù)處理方法通則》的規(guī)定[16]，空罐用自來水沖洗后用無殘留洗滌劑清洗，再用自來水反復(fù)沖洗后，用蒸餾水沖2～3次，置于烘箱中烘干。

1.2.2 遷移實(shí)驗(yàn)

依據(jù)GB 31604.1—2015《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品接觸材料及制品遷移試驗(yàn)通則》[9]，選擇相應(yīng)的食品模擬物以及浸泡條件對樣品進(jìn)行預(yù)處理。考慮到食品用金屬罐的實(shí)際使用條件，最終選定了包含蒸餾水、4%乙酸、10%乙醇、20%乙醇、50%乙醇(體積分?jǐn)?shù))和玉米油共6種食品模擬物進(jìn)行遷移實(shí)驗(yàn)，結(jié)合罐裝工藝，選擇的模擬條件，如表1所示。

1.2.3 浸泡液處理

參考GB 31604.10—2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品接觸材料及制品 2,2-二(4-羥基苯基)丙烷(雙酚A)遷移量的測定》[17]，水基食品模擬物浸泡液冷卻后過0.22 μm膜濾，進(jìn)色譜分析；玉米油模擬物冷卻后取1 g±0.01 g于10 mL離心管中，加入3 mL正己烷，搖勻后加入2 mL甲醇水溶液(1∶1,體積比)萃取，渦旋振蕩3 min，靜置分層后用注射器吸取1 mL下層水溶液過0.22 μm濾膜后進(jìn)色譜分析。每組實(shí)驗(yàn)平行3次，若樣品濃度高出線性范圍，則將浸泡液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后待測。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取苯酚、雙酚A、間甲基苯酚、鄰甲基苯酚、4-叔丁基苯酚的標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g(精確至0.1 mg)，除雙酚A用乙腈作溶劑外，其他4種酚用水定容至100 mL容量瓶中，制成濃度為100 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別精確量取1.00 mL各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液到10 mL容量瓶中，用水定容，制成標(biāo)準(zhǔn)混合溶液。依次精確量取0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 mL上述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL的容量瓶中，用水定容至刻度，得到苯酚、間甲基苯酚、鄰甲基苯酚、對叔丁基苯酚的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液為0.00、0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50 mg/L。采用同樣方式，分別用4%乙酸溶液和10%乙醇溶液配制同樣濃度系列的游離酚標(biāo)準(zhǔn)工作液。

對于玉米油標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別準(zhǔn)確稱取10 g(精確至0.01 g)玉米油至6個(gè)25 mL離心管中，分別移取0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 mL上述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于離心管中，得到苯酚、間甲基苯酚、鄰甲基苯酚、4-叔丁基苯酚、雙酚A的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液為0.00、0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50 mg/kg。分別取上述系列標(biāo)準(zhǔn)溶液1 g ± 0.01 g于10 mL離心管中，加入3 mL正己烷，搖勻后加入2 mL甲醇水溶液(1∶1,體積比)萃取，渦旋振蕩3 min，靜置分層后用注射器吸取1 mL下層水溶液過0.22 μm濾膜后進(jìn)色譜分析。

1.2.5 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse plus C18色譜柱(50 mm×2.1 mm×1.8 μm)；流動(dòng)相：乙腈、水，梯度洗脫見表2；流速：0.2 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：2 μL；熒光檢測器：激發(fā)波長235 nm，發(fā)射波長305 nm。

表2 流動(dòng)相梯度及流速Table 2 Gradient and flow rate of mobile phase

1.2.6 方法學(xué)分析

在優(yōu)化后的色譜條件下將混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液進(jìn)樣分析，各濃度平行5次，根據(jù)響應(yīng)值均值與濃度梯度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，外標(biāo)法定量。以最低標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度進(jìn)樣計(jì)算方法最低檢出限(S/N=3)與定量限(S/N=10)。選取實(shí)驗(yàn)用空罐樣品進(jìn)行游離酚的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，標(biāo)準(zhǔn)溶液的添加水平分別為0.03、0.05、0.08 mg/L，單次分析6個(gè)平行，分析方法回收率與精密度。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

參考國標(biāo)中雙酚A的色譜條件，分別以乙腈-水、甲醇-水為流動(dòng)相分析5種游離酚的分離度。當(dāng)流動(dòng)相選擇甲醇-水時(shí)，間甲基苯酚和鄰甲基苯酚不能得到有效的分離；而流動(dòng)相選擇乙腈-水時(shí)，間甲基苯酚和鄰甲基苯酚分離度良好。為了提高測定時(shí)效性，實(shí)驗(yàn)采用梯度洗脫(優(yōu)化后的梯度洗脫程序見表2)，從而使5種目標(biāo)物在有效分離的情況下，單次分析時(shí)間最短。其次對各游離酚的檢測波長進(jìn)行全掃描，結(jié)果顯示當(dāng)激發(fā)波長235 nm，發(fā)射波長305 nm時(shí)，靈敏度最佳，不同基質(zhì)下的色譜圖見圖1。

a-水；b-4%乙酸；c-10%乙醇；d-玉米油;圖中各峰分別為：1-苯酚；2-間甲基苯酚；3-鄰甲基苯酚；4-雙酚A；5-4-叔丁基苯酚圖1 食品模擬物中游離酚液相色譜圖Fig.1 Chromatogram of free phenol in food simulants

各游離酚分離度良好，水基食品模擬物(水、4%乙酸、10%乙醇)中目標(biāo)峰響應(yīng)值相近，而玉米油中各游離酚響應(yīng)值差異較大，且4-叔丁基苯酚的檢出限較高，可能對定量結(jié)果造成一定影響。該方法對于5種游離酚測定的峰型和分離度符合痕量物質(zhì)的測定要求。

2.2 線性范圍及檢出限

用遷移試驗(yàn)選用的食品模擬物水、4%乙酸溶液、10%乙醇溶液(20%乙醇溶液和50%乙醇溶液由于均為乙醇水體系，故只選擇10%乙醇溶液為代表)和玉米油分別配制標(biāo)準(zhǔn)工作液做標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照設(shè)定的色譜條件將游離酚各個(gè)濃度梯度進(jìn)樣分析，根據(jù)各個(gè)梯度濃度及其響應(yīng)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算檢出限(以信噪比S/N=3計(jì)算)和定量限(以信噪比S/N=10計(jì)算)，結(jié)果如表3所示。在0.01～0.500 mg/L線性范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)在0.969 5～0.999 9，檢出限為0.001～0.010 mg/L。

表3 食品模擬物中游離酚的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限及定量限Table 3 The linear equations, R, LOD and LOQ of free phenols in food simulants

2.3 回收率和精密度

使用遷移試驗(yàn)選用的食品模擬物水、4%乙酸溶液、10%乙醇溶液和玉米油分別進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)。分別在上述食品模擬物中添加5種游離酚的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，添加濃度水平分別為0.03、0.05、0.08 mg/L，經(jīng)遷移試驗(yàn)方法處理后進(jìn)行色譜分析，每個(gè)濃度平行6次，結(jié)果見表4。

表4 樣品加標(biāo)回收率和精密度(n=6)Table 4 The average recoveries and relative standard deviations of samples(n=6)

各游離酚的回收率在70.2%～118.8%，均值為90.7%，重復(fù)測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于7.2%。其中，玉米油基質(zhì)的重復(fù)測定RSD值高于其他基質(zhì)，與其響應(yīng)值較低有關(guān)。方法整體符合痕量物質(zhì)的檢測要求，該方法可實(shí)現(xiàn)食品金屬包裝中游離酚的遷移量的準(zhǔn)確檢測。

2.4 遷移量分析

依據(jù)不同型號、材質(zhì)、涂層類型以及接觸食品類型將49種食品金屬包裝空罐分為6個(gè)類型進(jìn)行了游離酚遷移水平調(diào)查。每個(gè)類別選擇不同的模擬物，單個(gè)樣品平行5次分析，結(jié)果取均值，見表5。

表5 樣品中游離酚特定遷移量實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 SML result of free phenol of samples

注：1.nd=未檢出，計(jì)算均值時(shí)設(shè)定nd=1/2 LOD；2./，表示不需考慮；3.總游離酚遷移量為5種游離酚遷移量之和。

49個(gè)樣品中苯酚檢出率為30.6%，遷移量最大值為0.123 mg/kg，平均值為0.014 mg/kg；雙酚A檢出率為89.8%，遷移量最大值為0.338 mg/kg，平均值為0.055 mg/kg；4-叔丁基苯酚檢出率為28.6%，遷移量最大值為0.059 mg/kg，平均值為0.009 mg/kg；間甲基苯酚檢出率為16.3%，遷移量最大值為0.035 mg/kg，平均值為0.012 mg/kg；鄰甲基苯酚檢出率為4.1%，只有2個(gè)陽性樣品；游離酚總遷移含量最大值為0.486 mg/kg，均值為0.092 mg/kg。結(jié)果表明，除苯酚和雙酚A外，其他3種游離酚類同樣均有檢出，也印證了不同種類的游離酚均存在一定的遷移風(fēng)險(xiǎn)。所有樣品中總游離酚的遷移量均在我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的安全限值之內(nèi)，其中有2個(gè)樣品的4-叔丁基苯酚遷移量超過限量值，超標(biāo)率為4.1%。雙酚A在所有樣品中檢出率和平均含量均為最高，若依照歐盟最新修訂的限量值，16個(gè)樣品中雙酚A的遷移量超過0.05 mg/kg，超過率為32.7%。

不同模擬物條件下，各游離酚檢出率和遷移量存在一定差異。其中，苯酚在乙醇體系中檢出率較高；4-叔丁基苯酚在20%和50%的乙醇體系中檢出率高于其他基質(zhì)；間甲基苯酚在50%乙醇體系中的檢出率高于其他基質(zhì)。而雙酚A在各類模擬物中(水除外)的檢出率均接近100%。結(jié)合國內(nèi)外對雙酚A及其衍生物的研究進(jìn)展，應(yīng)進(jìn)一步普查分析食品用金屬罐中雙酚A以及雙酚A類衍生物的遷移水平與遷移規(guī)律[18-20]，對其進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估以保證消費(fèi)者安全。其他4種游離酚均有離群值，表明不同企業(yè)的食品用金屬罐品質(zhì)參差不齊，品質(zhì)還有待標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)范化。

在乙醇體系的模擬物中，游離酚總遷移量高于其他基質(zhì)。在以水為模擬物的遷移實(shí)驗(yàn)中，各游離酚均未檢出，GB 31064.1—2015[9]規(guī)定對于乙醇含量低于10%的食品和不含乙醇的非酸性食品應(yīng)首選10%乙醇，如食品接觸材料及制品與乙醇發(fā)生酯交換反應(yīng)或其他理化改變時(shí)，應(yīng)選擇水作為模擬物，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明純水為模擬物不適合分析該類食品金屬罐的遷移情況，應(yīng)首選10%乙醇溶液。

將所有樣品依照結(jié)構(gòu)和涂層類型(僅限明確涂層的樣品，共計(jì)26個(gè))分類，分析其游離酚遷移量的差異，結(jié)果見表6。環(huán)氧酚醛類涂料涂層中總游離酚的平均遷移量高于環(huán)氧氨基和水基改性環(huán)氧樹脂；環(huán)氧酚醛和環(huán)氧氨基涂層的雙酚A的平均遷移量均高于水基改性環(huán)氧樹脂，且環(huán)氧氨基涂料涂層中雙酚A的平均遷移量最高，約為水基改性環(huán)氧樹脂的3倍。不同的罐型中，三片罐的各游離酚的遷移量以及遷移總量均高于兩片罐，總遷移量約為兩片罐的3倍。因此，雙酚A類物質(zhì)、環(huán)氧酚醛類涂料涂層以及3片罐應(yīng)是今后食品用金屬罐中游離酚遷移的重點(diǎn)研究對象。

表6 不同類型食品金屬包裝罐中游離遷移量分析Table 6 Analysis on the amount of free phenol migration in different types of food metal packaging cans

注：1.未檢出的樣品遷移量依照1/2 LOD計(jì)算；2.各游離酚遷移量為不同模擬物基質(zhì)條件下的平均值；3.總游離酚遷移量為5種游離酚遷移量之和

本研究建立的方法與GB 31604.46—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品接觸材料及制品游離酚的測定和遷移量》中總游離酚遷移量規(guī)定的滴定法相比，重點(diǎn)關(guān)注單個(gè)游離酚的檢測分析，便于后續(xù)對具體的游離酚種類進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估。由于樣本量以及罐體種類較少，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可能不足以反映目前食品用金屬罐中各種游離酚遷移量的風(fēng)險(xiǎn)情況，今后的分析中應(yīng)進(jìn)一步補(bǔ)充樣品種類和樣本量。此外，GB 9685—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品接觸材料及制品用添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[7]中規(guī)定苯酚的SML小于3 mg/kg，而GB 4806.10—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品接觸用涂料及涂層》[10]中規(guī)定食品接觸用涂料及涂層中游離酚的SML為3 mg/kg(以游離苯酚計(jì))，兩者在苯酚限量和總游離酚限量上存在一定的矛盾，應(yīng)在限量值上予以統(tǒng)一，否則會(huì)造成依據(jù)不同標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果存在差異。

3 結(jié)論

本研究建立了同時(shí)測定食品用金屬罐中苯酚、雙酚A、間甲基苯酚、鄰甲基苯酚、4-叔丁基苯酚5種游離酚的超高效液相色譜法。該方法的定量限低于國標(biāo)限量要求，方法線性好，精密度和回收率符合痕量物質(zhì)的檢測要求。該方法操作簡單，分析時(shí)間短，在15 min內(nèi)完成了5種游離酚的分離和檢測，為單個(gè)具體游離酚遷移量的分析檢測提供了方法支撐。對49種食品金屬包裝罐中5種游離酚的遷移水平分析結(jié)果表明，除2個(gè)樣品中4-叔丁基苯酚超過限量值之外，其他各游離酚遷移量以及總游離酚遷移量均在限量值以內(nèi)，雙酚A對總游離酚遷移量貢獻(xiàn)率最大。不同食品模擬物、不同罐內(nèi)壁涂層以及不同罐型條件下各游離酚的遷移量存在一定差異。在乙醇體系模擬物中游離酚遷移量高于其他基質(zhì)，食品用金屬罐內(nèi)壁環(huán)氧酚醛類涂料涂層中游離酚的遷移量高于環(huán)氧氨基和水基改性環(huán)氧樹脂，三片罐的各游離酚遷移水平以及總游離酚遷移量均高于兩片罐。應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注不同類型的內(nèi)壁涂層以及雙酚A及其衍生物的遷移水平及遷移規(guī)律。本研究結(jié)果將為食品用金屬罐中不同種類游離酚遷移量的測定方法以及限量標(biāo)準(zhǔn)的制修訂提供方法基礎(chǔ)與數(shù)據(jù)支撐。