陳巖君，竇文芳，李恒，史勁松，許正宏

1(江南大學(xué) 藥學(xué)院，糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫,214122) 2(江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫,214122) 3(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫,214122)

在正常情況下，人體主要通過肝臟對膽固醇進(jìn)行攝取，使血液中的膽固醇含量維持在正常范圍之內(nèi)。在肝臟攝取膽固醇的過程中，低密度脂蛋白受體(low-density-lipoproteinreceptor，LDLR)起主要作用。低密度脂蛋白(low-density-lipoprotein，LDL)是一種運(yùn)載膽固醇進(jìn)入組織細(xì)胞的脂蛋白顆粒。LDLR是一種膜鑲嵌式蛋白質(zhì)，能夠攝取血漿中的LDL-膽固醇從而降低其在血漿中的含量，在脂蛋白代謝中起關(guān)鍵作用[1-2]。

近年來，蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(proproteinconvertasesubtilisin/kexintype9，PCSK9)被發(fā)現(xiàn)是血漿LDL-膽固醇水平的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑[3]。PCSK9是哺乳動(dòng)物前蛋白轉(zhuǎn)化酶家族的可溶性絲氨酸蛋白酶[4]，主要由肝臟合成、分泌，在其他組織如腎臟、小腸、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、胰腺、結(jié)腸上皮和血管平滑肌細(xì)胞有較少的分泌[5-7]。PCSK9分泌到血液中，通過細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外2個(gè)獨(dú)立的方式與LDLR的表皮生長因子樣重復(fù)A(EGF-A)結(jié)構(gòu)域結(jié)合，誘導(dǎo)LDLR進(jìn)入溶酶體降解。當(dāng)血漿PCSK9水平升高時(shí)，肝細(xì)胞表面LDLR降解，影響血液中LDL-膽固醇的清除而導(dǎo)致LDL-膽固醇水平升高；當(dāng)PCSK9含量降低時(shí)，LDLR的水平升高，可以轉(zhuǎn)化更多的LDL-膽固醇[8-9]。因此，PCSK9被認(rèn)為是預(yù)防和治療高膽固醇血癥和心血管疾病的重要靶標(biāo)。

褐藻膠是一種由海洋褐藻生成的陰離子多糖，是由(1→4)連接的D-甘露糖醛酸(mannuronicacid，M)和其C5異構(gòu)體L-古洛糖醛酸(guluronicacid，G)組成的線性聚合物，以均聚(MM或GG)或異聚(MG或GM)方式排列組成。主要存在3種結(jié)構(gòu)片段：β-D- (1，4)連接的聚甘露糖醛酸片段(Polymannuronate，PM)，α-L-(1，4)連接的聚古洛糖醛酸片段(polyguluronate，PG)，G與M交替共聚的片段PMG[10-13]。褐藻寡糖可以通過酶解法或物理化學(xué)法降解褐藻膠制備。與化學(xué)和物理方法相比，酶解法具有高產(chǎn)量、污染小、可生成特定寡糖的優(yōu)點(diǎn)。研究顯示，褐藻寡糖能夠增加低密度脂蛋白的攝取，可開發(fā)成新一代降膽固醇藥物。但生物降解獲得的褐藻寡糖是聚合度不一的寡糖混合物，糖基組成和寡糖活性存在較大差異，嚴(yán)重影響了批次穩(wěn)定性及產(chǎn)品品質(zhì)，限制了其推廣應(yīng)用。該文采用IsoptericolahalotoleransCGMCC5336褐藻膠裂解酶制備褐藻寡糖，經(jīng)分離、純化后得到聚合度均一的寡糖，并研究了不同聚合度寡糖對HepG2細(xì)胞LDLR和PCSK9蛋白水平的影響，以期為后續(xù)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

嗜鹽白蟻菌(Isoptericolahalotolerans) CGMCC 5336，本實(shí)驗(yàn)室篩選并保藏的菌株。人肝癌細(xì)胞(HepG2)，購自中科院上海細(xì)胞庫。

1.2 主要儀器

Bio Gel P2(fine,45-90μm)，美國Bio-Rad公司；機(jī)械攪拌玻璃發(fā)酵罐Biotech-5JG(5 L)，上海保興生物設(shè)備工程有限公司；熒光定量PCR儀，美國Bio-Rad公司；蛋白電泳裝置，美國Bio-Rad公司；多功能酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 不飽和褐藻寡糖的制備

將嗜鹽白蟻菌CGMCC 5336接種于種子培養(yǎng)基，25 ℃、120 r/min培養(yǎng)24 h。按1%接種量(40 mL)接入罐上發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，8 000 r/min離心10 min去除菌體，用超濾法濃縮酶液，通過3,5-二硝基水楊酸(DNS)比色法測定酶的活性。1個(gè)酶活力單位(U)被定義為:1 min產(chǎn)生1 μg還原糖所需的褐藻膠裂解酶的量。將海藻酸鈉(12 g)溶解于1 L的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)中，加入52 200 U褐藻膠裂解酶，40 ℃反應(yīng)4 h，加水煮沸15 min停止酶反應(yīng)。8 000 r/min離心5 min除酶。根據(jù)大分子多糖和蛋白質(zhì)不溶于乙醇的特點(diǎn)，通過在酶解液中加入乙醇使其沉淀。將酶解液濃縮至約100 mL，加入無水乙醇至乙醇終濃度為60%，4 ℃沉淀過夜。收集上清液，濃縮并凍干，得到褐藻粗寡糖。

1.3.2 液相條件

色譜儀：WATERS ACQUITY UPLC；分析柱：BEH C18(2.1 mm×150 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相：A乙腈，B 0.1% 甲酸(A 2%，B 98%，0 min；A 10%，B 90%,8 min)；流速：0.3 mL/min；柱溫：45 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

1.3.3 質(zhì)譜條件

離子方式: ESI；毛細(xì)管電壓: 3.0 k；錐孔電壓: 20 V；離子源溫度: 100 ℃；脫溶劑氣溫度: 400 ℃；碰撞能量：6/20 Volts；質(zhì)量范圍(m/z): 20～1 000；Detector電壓: 1 800 V。使用MassLynx 4.1對樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理。

1.3.4 Bio-Gel P-2凝膠層析法分離寡糖

稱取褐藻粗寡糖150 mg，溶于1 mL 1 mol/L NaCl溶液中，用0.22 μm水膜過濾樣品，使用150 cm×1.0 cm Bio-Gel P-2凝膠柱進(jìn)行分離，流動(dòng)相為2.5 mmol/L Tris-1 mol/L NaCl溶液，流速為0.1 mL/min。于室溫下進(jìn)行分離，使用半自動(dòng)收集器收集樣品，每15 min收集1管。在230 nm測量吸光度值。將收集到的相同組分進(jìn)行合并。

1.3.5 MTT測定

(1)

1.3.6 熒光定量PCR

根據(jù)制造商的說明書使用Trizol提取總RNA。將RNA稀釋至40 ng/mL后，加入引物、模板對其進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，PCR條件為：25 ℃，10 min；48 ℃，40 min；95 ℃，5 min；12 ℃，∞。反轉(zhuǎn)錄總RNA以獲得cDNA。使用SYBR green premix進(jìn)行qRT-PCR，條件為50 ℃，2 min；95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min，45個(gè)循環(huán)擴(kuò)增。使用下列引物序列：人LDLR，5′-TTGGCTGCGTTAATGTGA-3′(有義)和5′-TGATGGGTTCATCTGACCAGT-3′(反義);人SREBP-2，5′-CAGTGGGACCATTCTGAC-3′(正義)和5′-TTCCTCAGAACGCCAGACTT-3′(反義);人PCSK9，5′-GCTGAGCTGCTCCAGTTTCT-3′(有義)和5′-AATGGCGTAGACACCCTCAC-3′(反義)：以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt對基因的表達(dá)水平進(jìn)行相對定量。

1.3.7 蛋白免疫印跡分析

在6孔板中加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，冰上靜置30 min后收集蛋白，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。配制10%分離膠和濃縮膠，每孔蛋白含量為30 μg，80 V條件下使蛋白樣品電泳至分離膠與濃縮膠之間時(shí)，調(diào)節(jié)電壓至100 V，樣品中的溴紛藍(lán)跑至電泳槽底時(shí)即可停止電泳。

將膠取出，與聚偏氟乙烯膜(PVDF)、濾紙、海綿組成三明治結(jié)構(gòu)，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中轉(zhuǎn)膜，然后將轉(zhuǎn)膜儀置于冰水浴中，100 V恒流轉(zhuǎn)膜100 min。用含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉1 h后，用TBST洗滌3遍，與一抗4 ℃孵育過夜，用TBST洗滌3遍，再與辣根過氧化物酶(HRP)-二抗孵育1 h后，用TBST溶液洗滌3遍，加入ECL化學(xué)底物發(fā)光試劑，凝膠成像儀檢測目的蛋白條帶，利用Image J軟件計(jì)算條帶灰度，以GAPDH作為對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 褐藻寡糖的制備

采用褐藻膠裂解酶對海藻酸鈉進(jìn)行酶解，得到褐藻粗寡糖命名為FrA。

2.2 LC-MS分析

通過LC-MS對FrA進(jìn)行分析。其液相分析圖如圖1所示，主要觀察到5個(gè)峰，其出峰時(shí)間分別為0.65、3.14、3.73、4.46、5.46 min。分別對5個(gè)峰進(jìn)行質(zhì)譜分析，峰1結(jié)果如圖2-a所示，確定該峰為雜質(zhì)峰。峰2的質(zhì)譜分析如圖2-b所示，其中質(zhì)荷比數(shù)351、703均可與寡糖的分子量相對應(yīng)，故可能為二糖或四糖。峰3的質(zhì)譜分析如圖2-c所示，其中質(zhì)荷比數(shù)527、1055均可與寡糖的分子量相對應(yīng)，故可能為三糖或六糖。峰4的質(zhì)譜分析如圖2-d所示，其中質(zhì)荷比數(shù)只有703與寡糖分子量相對應(yīng)，確定其為四糖。峰5的質(zhì)譜分析如圖2-e所示，確定其為四糖。則峰2為二糖，峰3為三糖，其所對應(yīng)的質(zhì)譜圖分別為二、三糖的質(zhì)譜圖。二糖質(zhì)譜圖中的703和三糖質(zhì)譜圖中的1055可能是兩個(gè)糖分子連在一起，即[2M-1]。

圖1 褐藻粗寡糖的液相圖譜Fig.1 The LC analysis of alginate oligosaccharides

圖2 褐藻粗寡糖的質(zhì)譜圖Fig.2 The MS analysis of alginate oligosaccharides

2.3 凝膠色譜分離

通過Bio-Gel P2凝膠柱對制備得到的褐藻粗寡糖進(jìn)行分離。使用0.25 mol/L Tris-1 mol/L NaCl緩沖液進(jìn)行洗脫，上樣量為1 mL，樣品質(zhì)量濃度為150 mg/mL，流速為0.1 mL/min，通過使用半自動(dòng)部分收集器對洗脫液進(jìn)行收集，每管1.5 mL。使用230 nm處的吸收值繪制分離曲線。結(jié)果如圖3所示，共得到4個(gè)組分，分別標(biāo)記為Fr1，F(xiàn)r2，F(xiàn)r3和Fr4，F(xiàn)r1中可能含有不同聚合度的寡糖。Fr2-4這3個(gè)組分分離度較好，可能為聚合度均一的寡糖。此外Fr1-Fr4分子量依次減小，F(xiàn)r4的分子量最小。

圖3 Bio-Gel P2洗脫曲線Fig.3 The isolation eluted of Bio-Gel P2

2.4 LC-MS分析

Fr1的液相圖如圖4所示，共含有2個(gè)峰，分別為峰1和峰2。在峰1的質(zhì)譜圖中，如圖5-a，質(zhì)荷比879可以與聚合度為5的褐藻寡糖的分子量相對應(yīng)，因此Fr1液相圖中峰1是五糖；峰2質(zhì)譜圖，如圖5-b，質(zhì)荷比1065、879、527分別對應(yīng)于聚合度為6、5、4的褐藻寡糖，由于峰2的分子量較峰1大，故確定Fr1中峰2為六糖。

圖4 Fr1的液相圖譜Fig.4 The LC analysis of Fr1

圖5 Fr1的質(zhì)譜圖Fig.5 The MS analysis of Fr1

在Fr2-Fr4的液相圖中，如圖6所示，均只含有1個(gè)液相峰。與FrA的液相圖譜相比較，F(xiàn)r2的液相圖如圖6-a，其液相峰保留時(shí)間為4.37 min，確定為四糖；Fr3的液相圖如圖6-b 所示，其液相峰保留時(shí)間為3.61 min，確定為三糖；Fr4的液相圖如圖6-c所示，其液相峰保留時(shí)間為3.12 min，確定為二糖。

圖6 Fr1的質(zhì)譜圖Fig.6 The MS analysis of Fr1

2.5 不同質(zhì)量濃度的4種組分對HepG2細(xì)胞活性的影響

通過MTT實(shí)驗(yàn)測定不同質(zhì)量濃度的Fr1-Fr4(0.062 5-1 mg/mL)對HepG2細(xì)胞活性的影響。結(jié)果如圖7所示。

圖7 Fr1-Fr4對HepG2細(xì)胞存活率的影響Fig.7 Cell viability of HepG2 cells exposed with Fr1-Fr4

當(dāng)用不同質(zhì)量濃度的4種組分刺激HepG2細(xì)胞12 h后，細(xì)胞存活率均在80%以上，表明Fr1-Fr4在1 mg/mL以下，對HepG2細(xì)胞的毒性較低。

2.6 四種組分對HepG2細(xì)胞LDLR基因及蛋白表達(dá)的影響

用1 mg/mL的Fr1-Fr4及FrA刺激細(xì)胞12 h，通過qRT-PCR檢測4種組分對HepG2細(xì)胞LDLR基因表達(dá)的影響。結(jié)果如圖8所示，F(xiàn)r4能夠顯著上調(diào)LDLR的轉(zhuǎn)錄水平。

圖8 Fr1-Fr4對HepG2 LDLR基因表達(dá)的影響Fig.8 Effects of Fr1-Fr4 on the gene expression of LDLR 注：*：p<0.05，**：p<0.01，p<0.001

通過Western Blot檢測4種組分對HepG2細(xì)胞LDLR蛋白表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖9所示，F(xiàn)r1、Fr3和Fr4均能顯著上調(diào)LDLR的蛋白表達(dá)水平，其中Fr4的調(diào)節(jié)作用最為顯著。LDLR的增加有利于肝細(xì)胞對血漿中LDL-膽固醇的攝取，從而降低血漿膽固醇水平。其中Fr4對LDLR蛋白表達(dá)水平的上調(diào)作用可能與其對LDLR轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)作用有關(guān)。而其他組分對LDLR的調(diào)節(jié)作用主要受其他因素的影響。

圖9 Fr1-Fr4對HepG2細(xì)胞LDLR蛋白表達(dá)的影響Fig.9 Effect of Fr1-Fr4 on the protein expression of LDLR 注：*：p<0.05，**：p<0.01，p<0.001

2.7 四種組分對HepG2細(xì)胞PCSK9蛋白表達(dá)的影響

通過Western Blot檢測4種組分對HepG2細(xì)胞PCSK9蛋白表達(dá)的影響，用1 mg/mL的Fr1-Fr4及FrA刺激細(xì)胞12 h。結(jié)果如圖10 所示，F(xiàn)r3對PCSK9蛋白表達(dá)水平有明顯下調(diào)作用，F(xiàn)r1和Fr2具有上調(diào)作用。Fr4對其調(diào)節(jié)作用不明顯。PCSK9增多，會(huì)造成LDLR的降解。當(dāng)PCSK9被抑制時(shí)，LDLR蛋白含量增加。所以，F(xiàn)r3對LDLR蛋白水平的上調(diào)作用可能與其對PCSK9的抑制作用有關(guān)。

圖10 Fr1-Fr4對HepG2細(xì)胞PCSK9蛋白表達(dá)的影響Fig.10 Effect of Fr1-Fr4 on the protein expression of PCSK9 注：*：p<0.05，**：p<0.01，p<0.001

2.8 Fr4對HepG2細(xì)胞SREBP-2基因表達(dá)的影響

LDLR基因表達(dá)主要受固醇反應(yīng)原件結(jié)合蛋白-2(SREBP-2)的調(diào)控，而Fr4對LDLR轉(zhuǎn)錄水平有明顯的上調(diào)作用。通過qRT-PCR考察Fr4對SREBP-2轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控作用。結(jié)果如圖11 所示，F(xiàn)r4能夠顯著上調(diào)SREBP-2轉(zhuǎn)錄水平。這表明，F(xiàn)r4對LDLR轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)作用可能與其對SREBP-2的激活作用有關(guān)。

圖11 Fr4對SREBP-2基因表達(dá)的影響Fig.11 Effects of Fr4 on the gene expression of SREBP-2 注：*：p<0.05，**：p<0.01，p<0.001

3 結(jié)論

通過Bio-Gel P2凝膠柱對酶解產(chǎn)生的褐藻粗寡糖進(jìn)行分離純化，得到聚合度均一的寡糖。在分離得到的4個(gè)組分中Fr1，F(xiàn)r3，F(xiàn)r4均能上調(diào)LDLR蛋白水平，其中Fr3和Fr4的活性更顯著。Fr4能夠上調(diào)LDLR轉(zhuǎn)錄水平，F(xiàn)r3能下調(diào)PCSK9的蛋白水平，這表明Fr4對LDLR蛋白水平的調(diào)節(jié)作用受LDLR轉(zhuǎn)錄水平的影響；Fr3對LDLR蛋白水平的上調(diào)作用與PCSK9的下調(diào)有關(guān)。而Fr4對LDLR轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)作用可能與SREBP-2的激活有關(guān)。