孫金鳳，田康明，沈微，陳獻忠，王正祥, *

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122) 2(天津科技大學(xué) 化工與材料學(xué)院，天津，300457)

木質(zhì)纖維素乙醇生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)之一是開發(fā)能有效代謝其水解液中的多種糖(主要是葡萄糖和木糖)為乙醇的菌種[1]。但是，到目前為止，還沒有任何一種天然的微生物能夠?qū)⒛举|(zhì)纖維素所有組成糖類轉(zhuǎn)化為乙醇[2-3]。過去幾十年，研究者們致力于開發(fā)能夠利用葡萄糖和木糖進行乙醇發(fā)酵的單一菌株，在乙醇發(fā)酵性能優(yōu)越的菌種(Saccharomycescereviseae,Zymomonasmobilis)中引入木糖代謝途徑，拓寬其底物利用范圍；或者在能天然利用多種糖類的菌株中引入乙醇合成途徑，已經(jīng)開發(fā)的產(chǎn)乙醇重組菌主要包括重組Saccharomycessp.,Zymomonassp.，Klebsiellasp.和E.coli[4-8]。但是由于葡萄糖阻遏效應(yīng)，木糖的利用滯后于葡萄糖，單一菌株乙醇發(fā)酵過程中木糖和葡萄糖的同步利用問題沒有得到很好解決[9-12]。此外，研究人員將利用不同糖類的不同微生物接種于同一體系進行共發(fā)酵，如S.cerevisiae和Pichiastipitis或Candidashehatae共發(fā)酵，Z.mobilis和Pachysolentannophilus或P.stipitis共發(fā)酵，以同步利用葡萄糖和木糖合成乙醇[13-14]。但不同微生物共發(fā)酵工藝與操作較為復(fù)雜，難以實現(xiàn)其工業(yè)應(yīng)用價值，因此基于同一親本菌株的底物選擇性菌株共發(fā)酵策略被成功用于乳酸、琥珀酸或乙醇發(fā)酵菌種改造[15-17]。

為此，本研究利用同一個E.coli親本菌株構(gòu)建了葡萄糖或木糖選擇性代謝大腸桿菌，然后將攜帶Z.mobilis乙醇合成途徑關(guān)鍵酶基因pdc和adhB的質(zhì)粒pEtac-PA[18]轉(zhuǎn)入2種底物選擇性菌株，獲得乙醇合成能力。通過發(fā)酵試驗，研究2種產(chǎn)乙醇重組菌共發(fā)酵時同步利用木糖和葡萄糖合成乙醇的發(fā)酵性能。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

本研究所用的菌株和質(zhì)粒見表1。E.coliB0013-1031 (pta-ackA,ldhA,pflB,frdA,xylH)為親本菌株，其中pta-ackA,ldhA,pflB和frdA基因在本研究室前期的研究中被刪除[19-20]，以阻斷乙酸、乳酸、甲酸和琥珀酸的形成；該菌株中木糖主要運輸載體XylFGH跨膜蛋白編碼基因xylH天然缺失[21]。其他菌株為本研究構(gòu)建。pMD18T-simple載體購自寶生物工程(大連)有限公司。攜帶Z.mobilis乙醇合成途徑關(guān)鍵酶基因pdc和adhB的質(zhì)粒pEtac-PA為作者前期構(gòu)建并保藏[18]。pSK-EcdifGm[22]由本研究室前期構(gòu)建并保存。pTH18Ks1-K12xylH′為作者前期構(gòu)建并保藏[21]，用于B0013-1031中天然缺失xylH的回復(fù)突變。

表1 本研究所用的菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

注：xylH*代表自然突變的xylH經(jīng)同源重組回復(fù)突變?yōu)檎Ｐ蛄衃21]。

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(5 g/L酵母粉, 10 g/L蛋白胨, 5 g/L NaCl)[24]作為菌株活化和培養(yǎng)的常規(guī)培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基添加15 g/L瓊脂。必要時培養(yǎng)基中添加100 μg/mL氨芐青霉素(Amp)、30 μg/mL慶大霉素(Gm)或50 μg/mL卡那霉素(Km)。改良M9培養(yǎng)基[20-21]添加5 g/L葡萄糖或木糖，作為種子培養(yǎng)基；或用于底物選擇性菌株選擇培養(yǎng)；以及搖瓶發(fā)酵試驗中細胞生長培養(yǎng)基；細胞生長結(jié)束，補加葡萄糖和木糖至各自終濃度為25 g/L，用于乙醇發(fā)酵。LB培養(yǎng)基和M9培養(yǎng)基均在121℃高壓蒸汽滅菌15 min備用。500 g/L葡萄糖或木糖貯備液在115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min備用。

1.3 基因操作

除非特別說明，常見的各種分子操作按照標(biāo)準操作方案進行[24]。xylH回復(fù)突變通過同源重組結(jié)合菌株篩選進行[21]；根據(jù)前期本實驗室建立的方法[20, 25]，利用Red重組系統(tǒng)和Xer重組系統(tǒng)，對木糖異構(gòu)酶編碼基因xylA、IICBGlc編碼基因ptsG、甘露糖PTS透過酶結(jié)構(gòu)域IIDMan編碼基因manZ和葡萄糖激酶編碼基因glk進行刪除，本研究所用的引物及其用途見表2。

表2 本研究所用的引物Table 2 Primers used in this study

續(xù)表2

引物名稱核苷酸序列(5’→3’)目標(biāo)刪除基因/回復(fù)基因用途manZ-p1-upACCAGCGAAGTACAGAACATGCmanZ-p2-downACGCACCATGATTCGTGACGTTGT-manZ-p1-rAGTGCCTGCATACGTTCGAAGTTCCAT-manZ-p2-rGTCCAGACTATTCTGGACCAGTTA刪除manZ擴增1.4 kb manZ;擴增1.9 kb manZ::dif-Gm突變盒;驗證轉(zhuǎn)化子擴增兩端含有manZ上下游同源臂的載體片段(3.5 kb),去掉manZ中間0.6 kb序列K12xylH’-p1CGGAATTCATGCTGTTCTTTACCTGGAK12xylH’-p2CGGGATCCAATGAGTATGCCGCGAAATGpTH-p23TCCCCCGGGCCTCTT CGCTATTA回復(fù)xylH擴增E. coli K12 xylH' (349 bp)引物K12xylH'-p1和pTH-p23驗證轉(zhuǎn)化子,預(yù)期擴增出500 bp片段

基本步驟為(1)目的基因刪除突變盒的制備：以染色體DNA為模板，擴增出要刪除的基因，PCR產(chǎn)物純化后克隆入載體pMD18 T-simple中，獲得重組質(zhì)粒；以此為模板，反向PCR擴增含有目標(biāo)基因上下游同源臂和載體的片段，并與dif-Gm-dif(1 kb)連接，獲得重組質(zhì)粒，以此制備突變盒xylA::dif-Gm、manZ::dif-Gm和glk::dif-Gm備用；突變盒ptsG::dif-Gm是實驗室前期研究中按照類似方法構(gòu)建完成[19]；(2)遺傳轉(zhuǎn)化與突變株的篩選：將突變盒片段電轉(zhuǎn)化入含有pKD46的目標(biāo)菌株中，通過菌落PCR確認突變菌株，進一步通過傳代消除Gm抗性基因和溫度敏感型質(zhì)粒pKD46。

1.4 培養(yǎng)試驗和發(fā)酵試驗

培養(yǎng)試驗和發(fā)酵試驗在500 mL三角瓶中進行，所有試驗平行測定3次，結(jié)果取平均值。

從LB平板接種新鮮的單菌落至50 mL LB培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。離心(4300g, 10 min)收集細胞，用M9培養(yǎng)基洗滌、重懸，接種50 mL種子培養(yǎng)基，接種后的初始細胞密度為0.1(OD600)，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至細胞密度為2.0～2.5(OD600)，離心收集細胞，用M9培養(yǎng)基重懸，接種含有5 g/L葡萄糖或木糖的細胞生長培養(yǎng)基或發(fā)酵培養(yǎng)基至最終體積為100 mL，初始細胞密度為0.1 (OD600)。單一菌株發(fā)酵試驗及雙菌株共發(fā)酵試驗時，2種菌株的種子液均分別制備。除非特別說明，保持每個菌株接種的初始細胞密度為0.1 (OD600)。

發(fā)酵過程分為2個階段，第一階段為好氧細胞生長階段，于37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。第二階段為厭氧發(fā)酵階段，培養(yǎng)物于37 ℃靜置發(fā)酵。轉(zhuǎn)移間歇，補加葡萄糖和木糖至各自終濃度為25 g/L。發(fā)酵過程中定時取樣分析細胞密度、底物葡萄糖/木糖濃度和產(chǎn)物乙醇濃度。

1.5 分析方法

采用UNICO UV2000分光光度計(尤尼柯(上海)儀器有限公司)測定600 nm的吸光度值(OD600, 1 cm光程)來監(jiān)控培養(yǎng)過程的細胞密度。葡萄糖、木糖和乙醇含量采用HPLC方法測定[19, 21]，色譜條件為： Shodex SH-1011色譜柱(Shodex SH-1011 H610009; Showa Denko K.K., Kawasaki, Japan)、示差檢測器，柱溫60 ℃，洗脫液為0.01 mol/L H2SO4，流速1.0 mL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 葡萄糖/木糖選擇性代謝大腸桿菌的構(gòu)建

E.coli中木糖主要是通過高親和力載體XylFGH運輸進入細胞，然后通過磷酸戊糖途徑進行分解代謝。木糖首先由木糖異構(gòu)酶XylA催化，異構(gòu)化形成木酮糖，然后由木酮糖激酶XylB催化形成木酮糖-5-磷酸[26-27]。刪除B0013-1031中木糖異構(gòu)酶編碼基因xylA，獲得了木糖不利用突變菌株E.coliB0013-2010。該菌株在以葡萄糖為唯一碳源的M9培養(yǎng)基上生長良好，而在以木糖為唯一碳源的M9培養(yǎng)基上不能生長。說明菌株B0013-2010中木糖利用途徑被成功阻斷。

通過同源重組方法，對B0013-1031中xylH的無義突變進行修復(fù)[21]，獲得回復(fù)突變株B0013-1031H。刪除B0013-1031H中與葡萄糖攝取代謝相關(guān)的3個基因ptsG,manZ和glk[28-31]，獲得了木糖選擇性利用菌株B0013-2011H。該菌株在以木糖為唯一碳源的M9培養(yǎng)基上正常生長，在以葡萄糖為唯一碳源的M9培養(yǎng)基上不能生長?？梢妱h除ptsG、glk和manZ，B0013-2011H中葡萄糖利用途徑被成功阻斷。

2.2 葡萄糖/木糖選擇性代謝大腸桿菌的生長特性

通過搖瓶培養(yǎng)試驗，驗證2種底物選擇性菌株的生長特性。在以葡萄糖或木糖為唯一碳源的M9培養(yǎng)基中，接種后于37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，B0013-2010利用葡萄糖生長，細胞密度達到5.08 (OD600)；在木糖M9培養(yǎng)基中細胞密度維持初始值0.1 (OD600)，基本不變(圖1)。而B0013-2011H利用木糖生長至OD600為4.24，在葡萄糖M9培養(yǎng)基中細胞密度基本維持在初始值不變(圖1)。

圖1 葡萄糖/木糖選擇性菌株E. coli B0013-2010和 B0013-2011H的生長量Fig.1 Biomass of E. coli B0013-2010 and B0013- 2011H on glucose or xylose

在其他條件相同時，B0013-2011H利用木糖生長的細胞密度略低于B0013-2010利用葡萄糖生長的細胞密度，這種差異可能會影響雙菌株共發(fā)酵過程葡萄糖和木糖的同步利用。要調(diào)節(jié)2種菌株的菌體密度盡可能相同，以實現(xiàn)2種糖的同步利用，可以從以下幾個方面進行嘗試：在不同時間點接種；采用不同的接種量；或針對影響生長的因素進行遺傳修飾[16]。研究2種底物選擇性菌株的接種方法，便于調(diào)節(jié)兩者生長盡可能一致。

在含有5 g/L葡萄糖和5 g/L木糖的培養(yǎng)基中，將B0013-2010PA和B0013-2011HPA分別單獨培養(yǎng)，以及按不同比例接種混合培養(yǎng)，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h，測定細胞密度，結(jié)果見表3。加大菌株B0013-2011HPA的接種比例，可以適當(dāng)提高混合培養(yǎng)物的細胞密度，但是仍低于單菌株培養(yǎng)細胞密度之和。將B0013-2011HPA分別提前2 h或1 h接種，然后再接種B0013-2010PA，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，則混合培養(yǎng)物的細胞密度分別達到9.48、9.16 OD600(表4)。

表3 B0013-2010PA和B0013-2011HPA分別培養(yǎng)及 不同比例接種培養(yǎng)的生長量Table 3 Biomass of B0013-2010PA and B0013-2011HPA cultivated separately, and cooperatively at different inoculation ratio

表4 B0013-2010PA和B0013-2011HPA分別培養(yǎng)及 錯開接種時間接種混合培養(yǎng)的生長量Table 4 Biomass of B0013-2010PA and B0013-2011HPA cultivated separately, and cooperatively at different inoculation time

可見，將B0013-2011HPA提早2 h接種，可獲得較高的細胞密度，是本研究雙菌株共發(fā)酵過程比較好的接種方法。

2.3 重組大腸桿菌利用葡萄糖、木糖或混合糖乙醇發(fā)酵

將攜帶Z.mobilis乙醇合成途徑關(guān)鍵酶基因pdc和adhB的質(zhì)粒pEtac-PA轉(zhuǎn)化2種底物選擇性菌株B0013-2010和B0013-2011H，得到產(chǎn)乙醇重組菌B0013-2010PA和B0013-2011HPA。利用單一菌株B0013-2010PA或B0013-2011HPA進行乙醇發(fā)酵。發(fā)酵過程分2個階段，首先在37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，然后將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱中37 ℃靜置發(fā)酵，結(jié)果見圖2和表5。

發(fā)酵10 h，B0013-2010PA消耗25 g/L葡萄糖，產(chǎn)生12.1 g/L乙醇(圖2-A)，乙醇合成速率為1.21 g/(L·h)，葡萄糖消耗速率為2.5 g/(L·h)(表5)，木糖質(zhì)量濃度基本保持不變。同樣條件下，發(fā)酵12 h，B0013-2011HPA消耗25 g/L木糖，合成11.85 g/L乙醇(圖2-B)，乙醇合成速率為0.99 g/(L·h)，木糖消耗速率為2.08 g/(L·h)(表5)，葡萄糖質(zhì)量濃度基本保持不變。

按照B0013-2011HPA提前2 h接種的方法，將2種底物選擇性重組菌B0013-2010PA和B0013-2011HPA接種至含有葡萄糖和木糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行共發(fā)酵。37 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱靜置發(fā)酵，培養(yǎng)物細胞密度為9.06 (OD600)。發(fā)酵24 h，消耗25 g/L葡萄糖和25 g/L木糖，合成24.22 g/L乙醇(圖2-C)，乙醇合成速率為1.01 g/(L·h)，葡萄糖和木糖消耗速率分別為2.02 g/(L·h)和1.05 g/(L·h)(表5)。同樣條件下，對照菌株B0013-1031HPA的木糖消耗明顯滯后于葡萄糖(圖2-D，表5)。可見，B0013-2010PA和B0013-2011HPA雙菌株發(fā)酵過程葡萄糖和木糖的同步利用問題得到明顯改善。

(A) B0013-2010PA; (B) B0013-2011HPA; (C) B0013-2010PA和B0013-2011HPA; (D) B0013-1031HPA(對照) ●-葡萄糖；◆-木糖；△-乙醇圖2 B0013-2010PA和B0013-2011HPA單一菌株及雙菌株利用葡萄糖和木糖的乙醇發(fā)酵性能Fig.2 Ethanol fermentation performance of B0013-2010PA, B0013-2011HPA ，and B0013-2010PA and B0013-2011HPA on mixed glucose and xylose

表5 發(fā)酵階段B0013-2010PA、B0013-2011HPA和 B0013-1031HPA的耗糖速率和乙醇合成速率Table 5 Consumption rates of sugars and production rate of ethanol by B0013-2010PA, B0013-2011HPA and B0013-1031HPA

菌株耗糖速率a/[g·(L·h)-1]葡萄糖木糖乙醇合成速率b/[g·(L·h)-1]B0013-2010PA2.501.21B0013-2011HPA 02.080.99B0013-2010PA + B0013-2011HPA2.021.051.01B0013-1031HPA2.020.750.87

注：a,耗糖速率是指發(fā)酵階段單位時間單位體積內(nèi)消耗的糖；b,乙醇產(chǎn)率是指發(fā)酵階段單位時間單位體積內(nèi)合成的乙醇。

利用木質(zhì)纖維素水解物發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，需要高效利用其中各種組成單糖，尤其是葡萄糖和木糖，木糖和葡萄糖同步消耗有利于提高乙醇生產(chǎn)效率。但是由于葡萄糖阻遏效應(yīng)，菌株總是優(yōu)先利用葡萄糖，對木糖的利用則相對滯后。將E.coli中葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶體系的ptsG基因突變，構(gòu)建的分解代謝物突變株雖然能夠同步利用葡萄糖、阿拉伯糖和木糖產(chǎn)生乙醇，但是由于葡萄糖主動運輸系統(tǒng)失活，突變株利用葡萄糖的生長變得緩慢，并且對水解產(chǎn)生的抑制物更為敏感[9]。

3 結(jié)論

本研究構(gòu)建的木糖選擇性利用菌株，由于阻斷了葡萄糖代謝途徑，在有葡萄糖存在的情況下可以不受葡萄糖阻遏效應(yīng)的影響，而優(yōu)先利用木糖。該菌株和葡萄糖選擇性菌株共發(fā)酵時，各自分別消耗葡萄糖和木糖，因此實現(xiàn)葡萄糖和木糖的同步利用。雖然在上述實驗條件下木糖和葡萄糖的消耗速率略低于單一選擇性菌株發(fā)酵過程，并且木糖消耗略有滯后。但與出發(fā)菌株相比，葡萄糖/木糖選擇性代謝菌株共發(fā)酵，顯著改善了混合糖乙醇發(fā)酵中葡萄糖和木糖的同步利用。為了更有效轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素水解物中的組成糖類為發(fā)酵產(chǎn)品，雙菌株共發(fā)酵過程還有待于進一步優(yōu)化。