◎ 宿華林，王 柳，牟 賀，孫玉葉，魏 登

（吉林農(nóng)業(yè)科技學院，吉林 吉林 132101）

黑果腺肋花楸，也稱不老莓或野櫻莓，是薔薇科腺肋花楸屬植物，原產(chǎn)于北美等地，目前在我國東北地區(qū)有大量種植。黑果腺肋花楸果實中的黃酮（鮮果含量高達到0.25%～0.35%）、花青素、多酚是已知植物中含量最高的，多糖的含量也較高。基于此，本文研究黑果腺肋花楸多糖的提取工藝，為黑果腺肋花楸的綜合利用開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料和設(shè)備

黑果腺肋花楸果實（鮮），購于吉林省安圖縣種植基地。試劑：無水乙醇、乙醚、濃硫酸、葡萄糖、1,1-二苯基苦基苯肼（DPPH）、乙醇、濃鹽酸、氫氧化鈉以及D-半乳糖等，均購于吉林市物華?；噭┯邢薰?。

分光光度計、精密天平、棕色容量瓶、1 mL移液管、吸耳球、小量杯、電子天平、微波消解儀、紫外-可見分光光度計、自動平衡離心機、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器以及真空干燥機等。

1.2 試驗方法

采用微波輔助法提取黑果腺肋花楸多糖，對料液比、微波功率和提取時間3種因素進行對比分析，確定多糖提取條件，并對黑果腺肋花楸多糖提取工藝進行響應面法優(yōu)化。稱取黑果（鮮果）100 g，制漿，用蒸餾水溶解漿液，采用微波消解儀輔助法提??；在5 000 r·min-1離心10 min后過濾，再加入蒸餾水二次提??；合并2次提取的上清液，以1∶6的比例用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮，至提取液體積最小。加入80%乙醇，靜置（8 h），再次5 000 r·min-1離心10 min，收集沉淀。用石油醚和無水乙醇進行脫脂，真空干燥，制得黑果粗多糖[4]。

1.2.1 單因素試驗設(shè)計

對料液比、微波功率和提取時間3個單因素進行試驗，確定提取工藝的最適條件。

1.2.2 響應面優(yōu)化

以料液比、微波功率和提取時間為自變量，提取量作為響應值，分析三因素與響應值之間的關(guān)系，采用響應面軟件中的Box-Behnken方法設(shè)計3因素3水平的響應面試驗。

1.2.3 多糖含量的測定

采用苯酚—硫酸比色法，測定黑果多糖含量，其計算公式[5]如式（1）。

人員、經(jīng)費、就業(yè)政策和就業(yè)場地等基礎(chǔ)性設(shè)施是保障獨立學院就業(yè)市場穩(wěn)定開展的前提條件。然而據(jù)調(diào)查，安徽省大多數(shù)獨立學院專職從事就業(yè)工作的人員僅2～3人，人員配備的匱乏制約了對就業(yè)市場錯綜復雜事宜的精雕細琢，限制了就業(yè)供需市場的維護和開拓；另外，雖然教育部對高校就業(yè)經(jīng)費的支出設(shè)定了指標，但是獨立學業(yè)受辦學的特點的局限，沒有能力完成這一指標，致使促進就業(yè)相關(guān)活動的資金存在不足；同時就業(yè)政策是就業(yè)市場規(guī)范化的標桿，多數(shù)獨立學院未建立與就業(yè)市場相關(guān)的制度，再由于教學用地的緊張，獨立學院甚至沒有安排傳統(tǒng)的招聘教室，現(xiàn)代化的視頻面試教室更是無從談起，以上都嚴重的影響了就業(yè)市場的現(xiàn)代化進程。

1.2.4 多糖含量的測定

用20 mL蒸餾水溶解10 g黑果腺肋花楸粗多糖，調(diào)節(jié)pH值為8.5，加入雙氧水使多糖溶液體積分數(shù)為40%，用恒溫水浴鍋在40 ℃下加熱4 h，分別用流水和蒸餾水透析8 h，蒸餾水每小時更換1次，得脫色多糖。脫色后的多糖溶液中加入1 g胃蛋白酶，在37 ℃下酶解 4 h后，沸水加熱 10 min，3 000 r·min-1離心10 min，去除變性蛋白質(zhì)，留上層清液用水,在60 ℃條件下透析2 d，透析后的溶液中加入Sevag試劑（三氯甲烷與正丁醇體積比為4∶1），混合后振蕩20 min，離心5 min，所得上層液為黑果腺肋花楸多糖溶液，重復以上步驟3次。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶液中的三氯甲烷和正丁醇，加入2倍體積的95%的乙醇溶液進行醇沉，即得脫蛋白后的多糖樣品。用所得黑果腺肋花楸多糖配置料液比為1∶100的多糖溶液，取10 mL多糖溶液至于層析袋中，用層析夾封好，在30 ℃條件下，于500 mL蒸餾水中靜置透析7 h，每2 h更換1次緩沖液，離心，過濾去除沉淀，將剩余清液低溫真空干燥后，得精制多糖。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖含量測定

采用苯酚-硫酸比色法，繪制葡萄糖標準曲線，其回歸方程為Y=7.756x+0.086 35，R2=98.93%

2.2 單因素試驗結(jié)果分析

如圖1所示，料液比從1∶7提高到1∶9時，黑果多糖提取量快速上升，隨著料液比的繼續(xù)提高，黑果多糖提取量呈緩慢下降趨勢?？紤]效價比和成本選擇料液比最佳比例為1∶9。如圖2所示，隨著微波功率提高，在500 W時，提取量最高，繼而呈現(xiàn)下降趨勢，故宜選微波功率500 W。如圖3所示，提取時間呈先升高后下降趨勢，25 min后延長提取時間出現(xiàn)下降趨勢，因此應選擇提取時間25 min，此時黑果多糖的提取率最高。

圖1 料液比對黑果多糖提取量的影響圖

圖2 微波功率對黑果多糖提取量的影響圖

圖3 提取時間對黑果多糖提取量的影響圖

2.3 響應面法優(yōu)化

2.3.1 響應面試驗設(shè)計及回歸方程的確立

以A（料液比）、B（微波功率）和C（提取時間）為自變量，Y（提取量）為響應值，進行響應面回歸擬合分析，見表1～2。

表1 實驗因素和水平表

表2 響應面試驗設(shè)計及結(jié)果表

從表2響應面試驗結(jié)果可知，影響黑果多糖提取的3個因素A、B和C與多糖提取量響應值Y之間的回歸方程為Y=+4.31+0.14A+0.22B+0.052C+0.065AB-0.030AC+0.17BC-0.52A2-0.78B2-0.30C2。

由表3可知，A、B、C三個因素與提取量（Y）之間的相關(guān)關(guān)系高度顯著，其中A、B、C、A2、B2和C2表現(xiàn)為高度顯著（P＜0.01），AB、AC、BC較顯著（P＜0.05），說明各自變量與因變量之間的關(guān)系不是簡單的線性關(guān)系，可以預測相應的數(shù)值，證明該試驗方案合理；失擬項P值為0.859 4＞0.05，為不顯著，表明誤差較小，擬合度高；從F值來看B＞A＞C，說明提取功率對黑果多糖提取量的影響最大，料液比次之，提取時間影響最小；R2＝0.996 3，R2Adj＝ 0.991 5，R2接近于1，該回歸模型的擬合度效果好。

2.3.3 響應面結(jié)果分析

該模型顯示微波功率對黑果多糖提取量的影響最大，料液比次之，提取時間最小，AB、BC之間具有明顯的交互作用，且P值均小于0.05，AC交互作用不明顯，P值大于0.05。

2.3.4 驗證實驗

試驗結(jié)果表明，微波輔助法提取黑果多糖的最佳工藝為：料液比1∶9.651（g·mL-1）、微波功率509.04 W、微波提取時間25.16 min，提取量為4.46%，綜合考慮實驗操作的可行性以及生產(chǎn)的實際成本，將結(jié)果修正為：料液比1∶10（g·mL-1）、微波功率500 W、微波時間25 min，并進行三次以上實驗驗證，實際測得黑果腺肋花楸多糖含量為（4.46±0.02）%，與預測值基本相符。

2.4 多糖純化

按照1.2.3黑果多糖含量的測定方法，得脫蛋白后的多糖樣品，用所得黑果腺肋花楸多糖配置料液比為1∶100的多糖溶液，取10 mL多糖溶液至于層析袋中，用層析夾封好，在30 ℃條件下，于500 mL蒸餾水中靜置透析7 h，每2 h更換1次緩沖液，離心，過濾去除沉淀，將剩余清液低溫真空干燥后，得精制多糖7.32 g

3 結(jié)論

采用微波輔助法提取黑果多糖，以A（料液比）、B（微波功率）和C（提取時間）為單因素，用響應面法對黑果腺肋花楸多糖提取工藝進行優(yōu)化，結(jié)果表明微波輔助法提取黑果花楸多糖的最佳工藝條件為：料液比1∶9.651（g·mL-1）、微波功率509.04 W、提取時間25.16 min，提取量預測為4.45%。綜合考慮實驗操作的可行性以及生產(chǎn)的實際成本，將結(jié)果修正為：料液比1∶10（g·mL-1）、微波功率500 W、微波時間25 min，并進行3次以上實驗驗證，實際測得黑果腺肋花楸多糖含量為（4.46±0.02）%。