余艷艷 譚云洪 陳振華 陳忠南 劉彬彬 王玨

結(jié)核病目前仍然是嚴重危害人類健康的全球公共衛(wèi)生問題。WHO指出，2016年全球1040萬例結(jié)核病感染者中10%的患者同時并發(fā)HIV感染；2016年全球130萬例結(jié)核病死亡患者中有37.4萬例并發(fā)HIV感染[1]。結(jié)核病是HIV感染者最常見的機會感染之一，是HIV感染者疾病進展的重要促進因素[2]。國外有研究報道[3],結(jié)核病是艾滋病患者(AIDS患者)(包括已接受抗病毒治療的患者)死亡的重要因素。HIV感染并發(fā)結(jié)核病由于病情復雜，因此診斷更為困難[4]。因此，在HIV感染者中對結(jié)核病進行早期篩查與診斷尤為重要。而HIV感染并發(fā)結(jié)核病患者的臨床癥狀不典型、影像學表現(xiàn)無特異性、實驗室病原學檢查陽性率低，從而導致診斷困難，延誤病情[5]。酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immune sorbent assay，ELISA)作為γ干擾素釋放試驗(interferon gamma release assay，IGRA)的一種檢測技術(shù)，在診斷結(jié)核病方面得到了越來越多的應用。因此，本研究通過對2015年1月至2018年9月湖南省胸科醫(yī)院就診的HIV感染并發(fā)結(jié)核病的患者采用包括ELISA在內(nèi)的3種檢測技術(shù)進行診斷性研究，以分析ELISA對HIV感染并發(fā)結(jié)核病的診斷價值。

資料和方法

一、研究對象

搜集2015年1月至2018年9月湖南省胸科醫(yī)院臨床就診的肺部疾病患者，共4568例，用ELISA法檢測血清HIV抗體陽性，并經(jīng)湖南省疾病預防控制中心采用免疫印跡法確診為陽性的患者114例。HIV感染者的診斷標準參照中華人民共和國衛(wèi)生部頒布的《艾滋病和艾滋病病毒感染診斷標準(WS 293—2008)》[6]。114例HIV感染患者中，按照《WS 288—2008 肺結(jié)核診斷標準》[7]，且經(jīng)過診斷性抗結(jié)核藥物治療，確診為HIV感染并發(fā)結(jié)核病患者95例，確診為HIV感染并發(fā)非結(jié)核性肺疾病患者19例。其中男100例(87.72%)，女14例(12.28%)；30歲以下年齡段10例(8.77%)，30～歲年齡段53例(46.49%)，50～歲年齡段47例(41.23%)，≥70歲年齡段4例(3.51%)。95例HIV感染并發(fā)結(jié)核病患者中包括5例繼發(fā)性肺結(jié)核并發(fā)淋巴結(jié)結(jié)核，3例繼發(fā)性肺結(jié)核并發(fā)結(jié)核性胸膜炎，7例繼發(fā)性肺結(jié)核并發(fā)淋巴結(jié)結(jié)核，1例繼發(fā)性肺結(jié)核并發(fā)腸結(jié)核，2例血行播散性肺結(jié)核，77例繼發(fā)性肺結(jié)核。19例HIV感染并發(fā)非結(jié)核性肺疾病中包括6例支氣管擴張，9例慢性阻塞性肺疾病(急性發(fā)作期)，1例非結(jié)核分枝桿菌(NTM)感染，3例肺部感染。

二、研究方法

(一)標本留取

用無菌肝素鈉抗凝管抽取每例患者的新鮮靜脈全血≥3 ml,進行ELISA檢測；均收集每例患者的痰標本(每份樣本≥3 ml)，同一份痰標本同時進行GeneXpert MTB/RIF(簡稱“GeneXpert”)和分枝桿菌BACTEC MGIT 960(簡稱“MGIT 960”)檢測。

(二)檢測方法

1.ELISA：采用?？诰S提璦生物研究院研制的結(jié)核分枝桿菌特異性細胞免疫反應試劑盒進行檢測。無菌技術(shù)下使用肝素鈉管采集的新鮮靜脈全血≥3 ml，于室溫儲存和運輸，16 h內(nèi)進行樣品刺激。編號反應管“樣本號-N”(表示陰性對照管)，“樣本號-P”(表示陽性對照管)，“樣品號-T”(表示檢測管)。分別加入相應的刺激劑(修飾后的培養(yǎng)濾液蛋白-10和早期分泌抗原靶-6)，吸取1 ml靜脈全血加入相應編號的反應管中并孵育22～24 h，將血漿上清移入標記好的1.5 ml Ependorff管(EP管)中。按照該試劑盒的說明書進行操作，酶標儀讀取450 nm處的光密度值(A值)。計算結(jié)果，得出(P-N)和(T-N)值。當N<0.5 IU/ml時，(T-N)/(P-N)≥0.60時判為陽性，否則為陰性。當N≥0.5 IU/ml，(T-N)/(P-N)≥0.85時判為陽性，否則為陰性(當P-N≥10 IU/ml 時，按P-N=10 IU/ml 計算)。

2.GeneXpert：按照GeneXpert操作說明書進行前處理。取1 ml痰標本加入管中，加入2倍痰體積的標本處理液，振蕩20 s后，靜置15 min，用專用吸管取2 ml處理后的標本液緩慢加入反應盒的加樣孔內(nèi)。開啟GeneXpert儀和電腦，待自檢通過后，將反應盒放入模塊中，系統(tǒng)自動進行核酸提取、擴增，以及目標序列的檢測和結(jié)果判斷。

3. MGIT 960：按照《分枝桿菌分離培養(yǎng)標準化操作程序及質(zhì)量保證手冊》[8]進行操作。

三、儀器與試劑

ELISA試劑盒由海口維瑅璦生物研究所提供。MGIT 960全自動分枝桿菌檢測系統(tǒng)及配套試劑由美國BD公司生產(chǎn)。GeneXpert檢測儀器和試劑盒均由美國Cepheid公司提供。

四、統(tǒng)計學處理

應用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析，對陽性率、敏感度、特異度、陽性預測值與陰性預測值的比較進行χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、 陽性檢出基本情況

95例臨床診斷的HIV感染并發(fā)結(jié)核病患者中，GeneXpert檢出陽性40例，陽性率為42.11%(40/95)；MGIT 960檢測陽性者45例，陽性率為47.37%(45/95)； ELISA檢測陽性者64例，其中不確定結(jié)果8例，陽性率67.37%(64/95)。ELISA檢測的陽性率高于GeneXpert和MGIT 960檢測，且差異有統(tǒng)計學意義(χ2=50.031，P=0.000)。19例HIV并發(fā)非結(jié)核性肺疾病患者中GeneXpert檢測陽性者0例； MGIT 960檢測陽性者0例； ELISA檢測陽性者 3例。

二、 ELISA試驗的診斷效能

以臨床診斷結(jié)果為標準，GeneXpert檢測的敏感度和特異度分別為42.11%和100.00%；MGIT 960檢測的敏感度和特異度分別為47.37%和100.00%； ELISA檢測的敏感度和特異度分別為73.56%和84.21%，見表1。

討 論

IGRA原理為檢測外周血單個核細胞或(和)全血在結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激下釋放γ-干擾素(IFN-γ)的水平，判斷受檢者是否感染結(jié)核。目前主要應用的檢測方法為：酶聯(lián)免疫斑點法(enzyme linked immunospot assay,ELISPOT)和ELISA[9]。IGRA目前主要在活動性結(jié)核病的輔助診斷、兒童MTB感染的排查和HIV感染等免疫抑制或免疫缺陷者MTB潛伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI)診斷中應用[10]。本研究結(jié)果顯示，ELISA檢測在HIV感染并發(fā)結(jié)核病中診斷的陽性率高于GeneXpert和MGIT 960，且差異有統(tǒng)計學意義；以臨床診斷結(jié)果為標準，ELISA檢測的敏感度高于GeneXpert和MGIT 960。

表1 以臨床診斷為標準3種檢測技術(shù)診斷HIV感染并發(fā)結(jié)核病的效能

注ELISA試驗中有8例HIV感染并發(fā)結(jié)核病者的結(jié)果不確定。敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陽性預測值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陰性預測值=真陰性例數(shù)/(真陰性+假陰性例數(shù))×100%

本研究中ELISA檢測的特異度為84.21%，低于GeneXpert和 MGIT 960。原因可能為本研究以臨床診斷結(jié)果為標準，有些患者為非結(jié)核分枝桿菌NTM和MTB的混合感染，但臨床上患者結(jié)核病表現(xiàn)不明顯；部分患者既往感染了MTB但為非活動性肺結(jié)核，本次是因為呼吸道其他疾病如支氣管擴張、慢性阻塞性肺疾病(急性發(fā)作期)就診；有些患者感染了與IGRA檢測抗原相交叉的NTM,如海分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌等有關(guān)；湖南省是結(jié)核病高發(fā)地區(qū)，不少患者為LTBI的可能性較大[11-13]。以上這些原因使得部分HIV感染并發(fā)非結(jié)核性肺疾病患者出現(xiàn)ELISA試驗陽性。有文獻報道，IGRA試驗檢測效能受MTB感染流行情況等影響，在低風險人群中檢測的特異度較好，但在有潛在MTB感染的高危人群中檢測的特異度明顯降低[14-16]。國外研究顯示，結(jié)核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)診斷HIV感染并發(fā)活動性結(jié)核病的敏感度和特異度分別為37.2%和88.7%[17]，并建議在免疫功能高度抑制的AIDS患者中不推薦T-SPOT.TB的診斷方法，敏感度低的原因可能與在晚期HIV感染的患者中CD4+T淋巴細胞數(shù)量減少及功能降低。然而T-SPOT.TB是否確實受CD4+T淋巴細胞數(shù)量及功能影響，目前尚有爭議；Nahid等[18]的研究顯示，在HIV感染并發(fā)結(jié)核病患者中，T-SPOT.TB檢測的陽性率并不受CD4+T淋巴細胞計數(shù)的影響。這些研究說明，T-SPOT.TB具有一定輔助診斷價值，但陰性檢測結(jié)果也不能完全排除結(jié)核病。有研究指出，ELISA和PPD試驗均是檢測患者細胞免疫反應，用MTB特異性抗原刺激患者T淋巴細胞，觀察是否有特異性細胞免疫反應來間接判斷是否感染MTB；因為正常人的CD4+T淋巴細胞約占總T淋巴細胞的65%，所以這兩種檢測方法均與CD4+T淋巴細胞計數(shù)和活性有關(guān)[19-20]。同時有文獻指出，ELISA陰性可以排除未受到嚴重免疫抑制的HIV感染成人的活動性結(jié)核病[21]。

有學者研究表明，由于ELISA試驗設(shè)置了空白對照管和陽性對照管，可以評價被檢者的基礎(chǔ)免疫狀態(tài)和試驗操作是否得當(陽性對照管)來排除受試者體內(nèi)嗜異性抗體效應和非特異性的IFN-γ等影響(空白對照管)，從而提高了方法學的可靠性[22-24]。HIV感染人群中，LTBI潛伏性感染者僅1年中就有約10%的幾率發(fā)展成活動性結(jié)核病，遠超非HIV感染人群[25]。LTBI和活動性結(jié)核病是相互關(guān)聯(lián)而非相互獨立的，特別是在HIV感染者中，可能在相當短的時間內(nèi)經(jīng)歷了LTBI、亞臨床結(jié)核病到活動性結(jié)核病的病情轉(zhuǎn)變[26]。因此，在HIV感染者中對LTBI者的早期檢測手段至關(guān)重要。由于ELISA檢測有著較高的敏感度和特異度，并且檢測快捷，故對HIV感染并發(fā)結(jié)核病的輔助診斷有一定的意義。

本研究不足之處在于：ELISA試驗中由于檢測管淋巴細胞產(chǎn)生IFN-γ受被檢者淋巴細胞數(shù)量、活力、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、是否吸煙、高濃度C反應蛋白(C-reaction protein，CRP)等多種因素影響[27-28]，本研究未能深入分析這些因素對檢測結(jié)果的具體影響，也不知8例不確定結(jié)果的具體原因。GeneXpert與 MGIT 960屬于病原學檢測方法，標本來源于痰液；ELISA屬于免疫學檢測方法，標本來源于血液。有研究顯示[29],痰標本的性狀與痰菌檢查結(jié)果密切相關(guān)，以干酪痰和膿性痰陽性檢出率較高，血性痰及泡沫樣痰陽性率較低。痰標本的性狀對GeneXpert和 MGIT 960檢測結(jié)果有一定影響。不同的標本來源及標本性狀對GeneXpert、MGIT 960與ELISA檢測結(jié)果存在不同影響。目前臨床上HIV感染并發(fā)結(jié)核病的病原學陽性檢出率低，鑒于ELISA檢測的高敏感度與特異度，故將其與GeneXpert及 MGIT 960進行比較，以臨床診斷結(jié)果為標準評價ELISA的臨床診斷價值。另外，由于本研究HIV感染并發(fā)非結(jié)核性肺疾病患者例數(shù)少，有待增大樣本量進一步研究，以便正確評價ELISA檢測技術(shù)在HIV感染并發(fā)結(jié)核病患者中的臨床診斷價值。