孟德梅 劉慶艷 郭雅君 樊振川 楊 瑞 生吉萍

（1 省部共建食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室 天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 天津 300457

2 天津科技大學(xué)大健康生物技術(shù)研究所 天津 300457

3 中國人民大學(xué)農(nóng)業(yè)與農(nóng)村發(fā)展學(xué)院 北京 100872）

自1972年Boman等[1]在惜古比天蠶中首次發(fā)現(xiàn)天蠶抗菌肽以來，人們在細菌、真菌、兩棲類、昆蟲、植物、哺乳動物、人類體內(nèi)等都發(fā)現(xiàn)了抗菌肽，種類超過3 400多種，現(xiàn)收錄于抗菌肽庫http：//aps.unmc.edu/AP/中[2]?？咕牡膩碓床粌H非常廣泛，而且具有相對分子質(zhì)量?。ㄍǔ?0～60個氨基酸），強陽離子性，良好的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性和蛋白酶穩(wěn)定性以及抑菌譜廣等多種優(yōu)點[3]，能夠選擇性地抑殺細菌或真菌。此外，還具有抗病毒，促進細胞愈合，免疫調(diào)節(jié)等作用[4]，在醫(yī)藥、養(yǎng)殖和食品等行業(yè)都有廣闊的應(yīng)用前景。然而，目前抗菌肽的應(yīng)用面臨著兩大難題：首先是天然抗菌肽的抗菌活力較差，其次是抗菌肽的穩(wěn)定性、溶血活性和細胞毒性難以調(diào)控[5-7]。隨著人們對抗菌肽分子結(jié)構(gòu)及功能機理的深入研究，在理論知識的基礎(chǔ)上，開始對其進行設(shè)計改造，期望獲得更加高效、穩(wěn)定及安全的抗菌肽產(chǎn)品[8-9]。本文結(jié)合近年來國內(nèi)外研究的進展，就如何對抗菌肽進行結(jié)構(gòu)改造以增強其活性，而不增加溶血性和細胞毒性進行概述。

1 抗菌肽的結(jié)構(gòu)與功能

1.1 抗菌肽的分子結(jié)構(gòu)

1.1.1 一級結(jié)構(gòu) 大多數(shù)抗菌肽的氨基酸數(shù)少于100個，而且不同物種同一抗菌肽的氨基酸數(shù)目及比例不同[2]。抗菌肽的N端富含親水性氨基酸如His、Lys等。C端富含有非極性疏水性氨基酸，如Ala、Val。這種兩親性結(jié)構(gòu)對抗菌肽結(jié)合細菌的細胞膜發(fā)揮重要作用，改變細胞膜的通透性從而產(chǎn)生抑菌活性[2]。一般情況下抗菌肽的一級結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，但在疏水性的環(huán)境中可通過轉(zhuǎn)換成高級結(jié)構(gòu)，保持一定的穩(wěn)定性，從而發(fā)揮抑菌作用[2]。

1.1.2 二級結(jié)構(gòu) 抗菌肽的二級結(jié)構(gòu)主要為α-螺旋、β-折疊、β-發(fā)夾結(jié)構(gòu)（loop 結(jié)構(gòu)）及延伸結(jié)構(gòu)（無序結(jié)構(gòu)）。其中，α-螺旋型抗菌肽因其數(shù)量較多，分布較為廣泛，并且具有廣譜抗性特征，是目前廣泛研究的抗菌肽[10]。正常情況下，抗菌肽并沒有表現(xiàn)出統(tǒng)一的4種二級結(jié)構(gòu)，當(dāng)抗菌肽與細胞膜接觸進入與脂質(zhì)結(jié)合的疏水部分才會表現(xiàn)出一些特定的二級結(jié)構(gòu)[11-12]。

1.1.2.1 α-螺旋 α-螺旋型抗菌肽的N端和C端分別呈親水性和疏水性，形成了帶正電荷的兩親性結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)對抗菌肽破壞細菌細胞膜發(fā)揮著極其重要的作用[13-15]。此類抗菌肽的α-螺旋之間有Pro或Gly形成的鉸鏈區(qū)[16]。而且大多數(shù)α-螺旋型抗菌肽由于不含有Cys，分子內(nèi)二硫鍵無法形成，常見的有 cecropins[17]，piscidins[18]，Magainins[19]，但是也有特例，如lactoferricin[20]。

1.1.2.2 β-折疊 反向平行的β-折疊及分子內(nèi)二硫鍵是此類抗菌肽的主要結(jié)構(gòu)特征。分子內(nèi)二硫鍵對抗菌肽結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性極其重要，使其更易于穿過細菌的細胞膜[21]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)，β-折疊型抗菌肽包含一種γ-核心區(qū)域（含兩個反平行的β-折疊），而且這個區(qū)域在許多動物防御肽中均有出現(xiàn)，這說明了γ-核心區(qū)域是宿主防御肽的保守區(qū)域[22-24]。β-折疊抗菌肽中含有1個二硫鍵的有brevinins[25]，Tachyplesin[26]等；含有 2 個二硫鍵的有protegin-1（含有典型的發(fā)夾結(jié)構(gòu)）[27]等；含有3個二硫鍵的有Mytichitin-CB[28]等。

1.1.2.3 β-發(fā)夾結(jié)構(gòu) 此類抗菌肽的C末端含有一個分子內(nèi)二硫鍵，使Loop結(jié)構(gòu)得以形成。Loop結(jié)構(gòu)含有二硫鍵形成的β-折疊結(jié)構(gòu)，有的也含有α-螺旋片段，而其N端保持著線性結(jié)構(gòu)。這類抗菌肽有bactenecin[29]。

1.1.2.4 伸展性片層 該類抗菌肽不含有Cys，通常富含Gly和Pro等。Pro和Gly富集形成的鉸鏈結(jié)構(gòu)阻斷抗菌肽分子產(chǎn)生α-螺旋或β-折疊，最終可形成無序的線性卷曲結(jié)構(gòu)。這類的抗菌肽有indolicidin[30]。

1.1.3 三、四級結(jié)構(gòu) 抗菌肽在特殊環(huán)境下還表現(xiàn)出一定的高級結(jié)構(gòu)。Won等[31]通過對抗菌肽GGN4的研究，結(jié)構(gòu)表明抗菌肽GGN4在水溶液中并沒有表現(xiàn)出固定的三級結(jié)構(gòu)，但是在脂質(zhì)溶液中不僅具有β-折疊結(jié)構(gòu)，還有α-螺旋結(jié)構(gòu)。采用核磁共振的方法對抗菌肽GGN4的三維結(jié)構(gòu)進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GGN4在50%TFE水溶液和80%甲醇水溶液中表現(xiàn)出了不同的三維結(jié)構(gòu)。O-man等[32]對乳酸鏈球菌肽研究發(fā)現(xiàn)，該肽在水溶液中表現(xiàn)出的結(jié)構(gòu)較為靈活，而在DMSO或TFE的溶液中的分子結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定。

1.2 抗菌肽的抑菌機理

不同種類的抗菌肽對同一類型菌的抑菌機理，以及同一種類的抗菌肽對不同類型菌的抑菌機理都是不同的。目前假設(shè)的作用機理有破壞細胞膜形成[33-39]；抑制細胞壁的形成[35，40-43]；抑制細胞呼吸作用[44]；與細胞內(nèi)生物大分子核酸[45-47]，蛋白[48-49]結(jié)合，影響了基因轉(zhuǎn)錄表達和調(diào)控，進而對細胞內(nèi)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生影響。然而，無論哪種機制都要經(jīng)過吸引、附著、插入、定向幾個過程，與細菌細胞進行接觸。

α-螺旋型抗菌肽通常是憑借靜電引力結(jié)合到細菌細胞膜上。其C端憑借疏水作用與磷脂結(jié)合，插入細胞質(zhì)膜，使細菌細胞膜結(jié)構(gòu)破壞。而且抗菌肽分子的單體會不斷聚集，導(dǎo)致形成的離子通道孔徑不斷增大，使得內(nèi)容物不斷流出，最終致使細菌死亡[13-15，50]。

β-折疊和β-發(fā)夾結(jié)構(gòu)抗菌肽的抑菌機理與α-螺旋型抗菌肽相似，都是依賴于兩親性結(jié)構(gòu)特點，破壞細菌的細胞膜致其死亡[51]。此外，研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽β-defensin可阻礙細菌細胞的形成，使細胞形態(tài)異常，最終使細菌死亡[52]。

伸展性片層結(jié)構(gòu)的抗菌肽在細胞質(zhì)發(fā)揮作用。抗菌肽利用Pro、Gly鉸鏈區(qū)的扭曲及彈性的性質(zhì)，穿過細菌細胞膜，進入到細菌細胞質(zhì)中與核酸或蛋白質(zhì)結(jié)合，影響了基因轉(zhuǎn)錄表達及調(diào)控，進而使細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能受到影響，最終致使細菌死亡[53]。

1.3 抗菌肽的選擇性機理

細菌及真菌細胞表面的膜脂成分都含有負電荷，而哺乳動物細胞膜脂成分則以中性的磷脂為主。帶正電荷的抗菌肽通過靜電引力靶向地與細菌和真菌細胞結(jié)合，對哺乳動物細胞基本無害，因此具有選擇殺傷性[54]。然而，有研究表明，疏水性太高會使抗菌肽喪失這種選擇性，這是因為抗菌肽疏水性的增強，提高了抗菌肽分子間的疏水作用，更易發(fā)生自聚合。這種聚合作用的產(chǎn)生，雖然使得抗菌肽裂解細菌細胞膜的能力提高，但是降低了其通過細菌細胞壁的能力，而與哺乳動物細胞的細胞膜結(jié)合效率增加，最終提高了抗菌肽對哺乳動物細胞的溶血活性[55]。因此，可以通過改變抗菌肽的疏水性來優(yōu)化對其原核細胞膜和真核細胞膜的選擇性，同時保持其抑菌能力。

2 抗菌肽活性的調(diào)控因素

2.1 正電荷

大多數(shù)抗菌肽在自然pH下帶正電荷，而帶正電荷的性質(zhì)是抗菌肽的重要特征之一?？咕牡倪@種特征使得它可通過正負電荷之間的靜電引力與帶負電荷的細菌細胞膜結(jié)合，使細菌細胞膜破裂或形成孔洞[56]。正電荷數(shù)目的增加不僅可以提高抗菌肽與細菌細胞膜的結(jié)合能力，還能有效降低抗菌肽的殺菌濃度[57]。2006年，Ahn等[58]將抗菌肽Tenecin 1的α-螺旋區(qū)域的氨基酸用Arg、Lys替代，增加了其凈電荷數(shù)量，從而賦予了其抗菌活性，而且并沒有增加其溶血活性。2009年Carvalho等[59]將Rr-AFP2的第39位的Gln用Lys替換，抗菌活性增強，然而，將第44位Lys替換為Gln時，抗菌活性降低；表明并不是在所有位置增加正電荷的數(shù)量都可以使其抗菌活性增強。

研究表明，當(dāng)正電荷數(shù)量到達一定數(shù)值后，抗菌肽的抗菌活性不但沒有提升，反而有所下降，而其溶血活性有所增加[60]。Zhu等[61]將抗菌肽LV13K進行了氨基酸的替換，得到了凈電荷數(shù)從-5到+10不等的一系列類似物。研究結(jié)果表明：凈電荷數(shù)較低時，抗菌肽抑菌活性較低；當(dāng)凈電荷數(shù)從+4增長到+8時，抗菌肽的抑菌活性有所提高；當(dāng)凈電荷數(shù)由+8增長到+10時，抑菌活性保持穩(wěn)定或有所下降，而其溶血活性卻明顯升高。這是由于過高的正電荷數(shù)使抗菌肽分子之間的靜電斥力增大，并超過了抗菌肽與細菌細胞膜的靜電引力，從而不利于抗菌肽和細菌細胞膜的結(jié)合，使抗菌肽的抗菌活性降低。Gagnon等[62]研究發(fā)現(xiàn)正電荷對抑菌活性的影響還與肽鏈的長度有關(guān)。肽鏈長度相同的情況下，當(dāng)肽鏈較長時，帶有較多正電荷的抗菌肽的抑菌效果優(yōu)于少量正電荷的抗菌肽；當(dāng)肽鏈較短時，用Lys取代Ile后，正電荷數(shù)目增加，然而抑菌活性降低。

綜上所述，控制抗菌肽的凈電荷數(shù)目在+4到+8的范圍內(nèi)有助于提高其抗菌活性。可通過替換氨基酸的方法適當(dāng)改變親疏水性氨基酸的數(shù)目或順序，可提高抗菌肽的抗菌活性。值得注意的是，電荷數(shù)目變化對抑菌活性的影響還與肽鏈長度有關(guān)。

2.2 疏水性

抗菌肽的疏水性是影響抗菌肽抗菌活性的重要因素之一[63]。疏水性太低致使抗菌肽與細菌細胞膜的親和力過低，無法與之結(jié)合；太高的疏水性易使抗菌肽自我聚集，不僅抗菌肽分子的溶解性降低，并且會導(dǎo)致其溶血活性增加。氨基酸側(cè)鏈的疏水性和側(cè)鏈間的疏水相互作用是影響其疏水性的主要因素[50，64]。

Lee等[65]分別將抗菌肽HP的Gln16和Asp18用Trp替代，提高了抗菌肽的疏水性，研究發(fā)現(xiàn)它們的抗菌活性得到了提高；其中疏水性最高的抗菌肽其抗菌活性也最高。Zhu等[54]研究表明，提高抗菌肽的疏水性，其抗菌活性得到提高，而抗菌肽的溶血活性也提高，而且溶血活性提高的幅度大于抗菌活性提高的幅度，即降低了抗菌肽的治療指數(shù)。Ayman等[66]研究表明，增加抗菌肽的疏水力矩和疏水性使得抗菌肽的抗菌活性降低，溶血活性增加；降低疏水力矩和疏水性，使抗菌肽的溶血活性降低。

綜上可知，疏水性對抗菌活性的影響比對溶血活性的影響程度小。對于較低疏水性的抗菌肽，可通過適當(dāng)增加疏水性氨基酸的數(shù)量來增強抗菌活性，同時避免其溶血活性的增加。對于較高疏水性的抗菌肽，可降低其疏水性使其選擇殺傷性增加，溶血活性降低。

2.3 螺旋度

α-螺旋結(jié)構(gòu)在抗菌肽肽鏈的N端易于形成，可通過替換氨基酸來提高其螺旋性，使其穩(wěn)定性提高[67]。例如，蜂毒素N端的Gly被去除或被Leu代替，其螺旋性提高，同時也使抗菌活性及溶血活性升高[68]。然而，這種活性的改變是綜合影響的結(jié)果，因為螺旋度的變化會影響凈電荷數(shù)、疏水性及疏水力矩等的變化。Gagnon等[62]在保持正電荷數(shù)目和肽鏈長度不變的情況下，將Ile用Lys替代后，發(fā)現(xiàn)抗菌肽的抑菌活性因螺旋度的消失而降低。有報道指出在凈電荷數(shù)和疏水性不受影響的前提下，用不利于螺旋形成的D-型氨基酸替換L-型氨基酸，可以使其螺旋含量降低[69]，而低螺旋度也是降低溶血活性的有效方法[70]。

此外，大量研究表明，抗菌肽的螺旋性對動物細胞毒性的影響要比其抑菌活性更為顯著，而D-型氨基酸是控制螺旋性的關(guān)鍵因素[71]。Oren等[72]將抗菌肽melittin B中的4個L-型氨基酸用其同分異構(gòu)體D-型氨基酸替換后，仍能保持其原有的電荷和親疏水性，然而α螺旋結(jié)構(gòu)由原來的73%降低為15%，最終降低了抗菌肽對哺乳動物的細胞毒性，可以保持其原有的抑菌活性。Papo等[73]對D-型氨基酸多肽和L-型氨基酸多肽結(jié)構(gòu)與功能進行分析，結(jié)果表明D-型氨基酸與L-型氨基酸相比，表現(xiàn)出較低的溶血活性及較高的抑菌活性和水溶性。此研究結(jié)果為解決抗菌肽的細胞毒性提供了新思路。

2.4 兩親性

α-螺旋結(jié)構(gòu)具有水脂兩親性[74]；親水性氨基酸與疏水性氨基酸分別集中分布在α-螺旋抗菌肽的N端與C端，形成親水端與疏水端[75]。疏水力矩是用于對多肽的兩親性指標(biāo)的定量描述[76]。研究表明，平均疏水力矩對抗菌活性的影響要大于螺旋度和疏水性對抗菌活性的影響，具有較強裂解細菌細胞膜能力的α-螺旋型抗菌肽大部分都具有較高的疏水力矩[75]。因此，適當(dāng)調(diào)節(jié)疏水力矩有利于抗菌肽活性的提高。

Pathak等[77]研究表明，降低Melittin的疏水力矩，其抗菌活性和溶血性也會降低。Fazren等[78]合成了兩端分別為疏水性氨基酸和強陽離子氨基酸的兩親性短肽，并證明了其具有抗菌活性。Fernandez等[79]通過L型和D型氨基酸交替排列，設(shè)計出了僅含8個氨基酸殘基的α-螺旋型多肽鏈，并證明了這條氨基酸肽鏈的抑菌活性較強。

2.5 特殊氨基酸及氨基酸數(shù)目

研究表明，抗菌肽多肽鏈中某些特殊的氨基酸殘基跟其抑菌活性有密切聯(lián)系。如富含Arg和Val的α-螺旋抗菌肽的抑菌活性較高，其原因是這類抗菌肽具有更強的靜電膜吸附作用[80]。此外精氨酸可以使陰離子膜上的磷脂形成環(huán)形孔[81]，纈氨酸可促進β-折疊片層的延伸[82]。

研究表明Pro和Gly的富集對于線性狀的抗菌肽的生物活性發(fā)揮著極其重要的作用?？咕呐c膜脂之間的氫鍵對抗菌肽維持活性結(jié)構(gòu)至關(guān)重要[83]。脯氨酸是最保守的氨基酸，它決定了抗菌肽的作用方式是進入細胞膜與胞內(nèi)大分子發(fā)生作用。Lee等[84]通過人工合成抗菌肽P1（KWKLFK KIPKFLHLAKKF-NH2），并分別逐一切除其 C端和N端的氨基酸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Pro對其抗菌活性發(fā)揮著重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)約70%的抗菌肽的第一位氨基酸殘基為Gly，抗菌肽的氨基酸序列的第一個氨基酸是Gly的這種特征有利于抗菌肽結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定[85]。因此，在設(shè)計合成抗菌肽時，使Gly盡可能作為肽鏈的第一個氨基酸。

此外，抗菌肽結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性也受肽鏈長度的影響，從而抑菌活性也受到肽鏈長度的影響。Phambu 等[86]通過紅外（FTIR）、掃描電鏡（SEM）、熱重分析（TGA）及微分掃描量熱法（DSC）研究（RW）n表明理想的肽鏈長度可以增加分子內(nèi)氫鍵作用，從而保持肽鏈的穩(wěn)定性，進而與陰離子的脂質(zhì)更好結(jié)合，發(fā)揮更強的抑菌作用。Gagnon等[62]在保持電荷數(shù)目不變的情況下，通過改變KIA序列長度，發(fā)現(xiàn)序列長度只有在一定范圍內(nèi)才能保持較高的活性?？咕囊M入細菌細胞質(zhì)膜內(nèi)發(fā)揮抑菌作用，必須先穿過細菌細胞壁和細胞膜。因此，抗菌肽抑菌活性的大小和細菌細胞壁以及細胞膜的厚度有關(guān)，也就意味著抗菌肽多肽鏈長度是影響其抑菌活力大小的關(guān)鍵因素之一[87]。

3 小結(jié)與展望

影響抗菌肽活性的因素多種多樣，如正電荷數(shù)、螺旋度、親疏水性、疏水力矩、特殊氨基酸以及肽鏈的長度等，這些因素相互聯(lián)系并相互制約。充分了解這些因素對其活性和選擇性的影響，并對各個方面有一個整體的把握，將更加有利于對抗菌肽結(jié)構(gòu)做有針對性的設(shè)計改造。在盡量保留抗菌肽本身結(jié)構(gòu)優(yōu)勢的前提下，通過氨基酸的替換，雜合肽的構(gòu)建，化學(xué)庫組合法設(shè)計全新抗菌肽等改造手段，得到具有高抑菌活性、高穩(wěn)定性和低溶血活性、低細胞毒性的新型抗菌肽，這將會是近年來抗菌肽發(fā)展的重要方向。而且隨著結(jié)構(gòu)生物學(xué)的發(fā)展，抗菌肽的三維結(jié)構(gòu)被進一步精確測定，計算機圖形、圖像顯示技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展，使得抗菌肽結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系以及分子設(shè)計得以在三維結(jié)構(gòu)上進行定性、定量研究。這將對抗菌肽的發(fā)展和廣泛應(yīng)用起到至關(guān)重要的推動作用。