丁同慧 柳柯 閻艾慧*

1中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（沈陽110001）

2首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（北京100050）

隨著現(xiàn)代社會城市化水平的發(fā)展，人們遭受噪聲暴露的機(jī)會大大增加，噪聲污染已成為一個(gè)影響人類健康的重大課題[1]。相對于高強(qiáng)度噪聲（120dB以上）而言，中等偏強(qiáng)的噪聲刺激一般不會導(dǎo)致聽閾的永久改變，受暴露者的聽閾變化多可在數(shù)天至半月內(nèi)得到恢復(fù)[2-4]。但是，這些結(jié)論都是在相對較為年輕的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中獲得的，因而只能用于推斷青壯年人群接受類似噪聲暴露的情況。對于中年人群或者接近老年的那部分人群，如果他們遭受同等強(qiáng)度的噪聲暴露會出現(xiàn)哪些聽功能方面的改變，目前尚缺乏相關(guān)的研究證據(jù)。

目前世界上越來越多的國家均步入老年化社會，由于中老年人整體損傷修復(fù)能力下降，我們推測他們對于噪聲暴露后的聽覺損傷修復(fù)能力也會隨之下降。為了驗(yàn)證這個(gè)假設(shè)，本研究計(jì)劃采用聽功能老化早期的6月齡C57小鼠作為實(shí)驗(yàn)對象，采用110dB白噪聲對小鼠進(jìn)行暴露，并分別于暴露后不同時(shí)間點(diǎn)觀察其聽功能變化情況；進(jìn)一步，本研究還將觀察小鼠耳蝸毛細(xì)胞、帶狀突觸以及毛細(xì)胞中線粒體損傷情況，以進(jìn)一步闡明聽功能變化的分子病理機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

1.1.16 月齡小鼠實(shí)驗(yàn)：選擇6月齡SPF級標(biāo)準(zhǔn)的雄性C57BL／6J小鼠，實(shí)驗(yàn)前檢查小鼠外耳，排除有外耳及中耳炎癥小鼠。并對余下小鼠行聽力檢測，聽力正常者做為本研究的實(shí)驗(yàn)及對照組小鼠。本研究將小鼠隨機(jī)分成4組，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對照組，每組4只，共計(jì)16只。實(shí)驗(yàn)組按照暴露后時(shí)間分為暴露后1天組（P1)、噪聲暴露后7天組（P7)和噪聲暴露后14天組（P14)，未接受噪聲暴露組作為對照。

1.1.2 2月齡小鼠實(shí)驗(yàn)：本月齡小鼠聽力檢測、動(dòng)物數(shù)量、分組及噪聲暴露方法均與六月齡小鼠相同。

本實(shí)驗(yàn)研究通過首都醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，并嚴(yán)格按照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理規(guī)定進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購自北京維通利華公司。

1.2 噪聲暴露

聲音文件由Cool Edit Pro軟件（Adobe Systems,USA）合成。 通過音箱（JBL KP6000,PROFESSIONAL by HARMAN,USA）輸出110dB SPL寬頻帶白噪聲對各實(shí)驗(yàn)組小鼠進(jìn)行噪聲暴露，暴露持續(xù)2小時(shí)。暴露時(shí)將小鼠置于自制的鼠籠中，鼠籠空間盡可能狹小，本研究采用的小鼠籠尺寸為4cm 4cm 16cm。揚(yáng)聲器置于鼠籠之上，為了確保鼠籠之內(nèi)聲音強(qiáng)度誤差在1dB之內(nèi)，實(shí)驗(yàn)前我們應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)聲級計(jì)對聲音進(jìn)行校準(zhǔn)，以確保鼠籠中聲音強(qiáng)度符合實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 聽力檢測

本研究采用美國TDT測聽設(shè)備（TDT,Alachua,Florida,USA），Biosig測聽軟件對小鼠進(jìn)行ABR閾值檢測。測聽在隔聲屏蔽室內(nèi)進(jìn)行，測聽前使用10%水合氯醛(O.005ml/g,腹腔注射)對小鼠進(jìn)行麻醉。麻醉滿意后，將記錄電極置于小鼠兩側(cè)耳廓前緣連線中點(diǎn)皮下，參考電極置于測試耳耳后皮下，接地電極置于對側(cè)耳耳后皮下，發(fā)聲喇叭距外耳道口約0.5cm。此外，將麻醉好的小鼠置于保溫?zé)崴暇S持體溫。實(shí)驗(yàn)采用短聲(Click)和短純音(Toneburst，Rise／Fall time：1 ms；Durmion：4 ms)作為刺激聲，帶通濾波為300～3000Hz，疊加次數(shù)為1024次，掃描時(shí)間10ms。聲音強(qiáng)度自90dB開始，以10dB逐漸遞減，直至檢測不出重復(fù)的ABR波形，再向上遞增5dB，直至能檢測出重復(fù)的ABR波形，此刺激聲強(qiáng)度即為小鼠的聽閾。

1.4 耳蝸基底膜取材

各組小鼠測聽完成后即以頸椎脫臼法處死，斷頭并去除腦組織，分離顳骨與耳蝸，去除蝸殼，將耳蝸置入4%多聚甲醛的培養(yǎng)皿中。在顯微鏡下使用顯微鑷戳破蝸頂，前庭窗和蝸窗，灌注多聚甲醛，4h C冰箱過夜。第二天標(biāo)本用10%EDTA溶液脫鈣12h。脫鈣完成后置于PBS培養(yǎng)皿中，緩慢剝?nèi)ボ浕奈仛ぃ巴ツぜ吧w膜，隨后分離蝸軸和基底膜，按頂、中、底回分為三段[5]。

1.5 免疫熒光染色

應(yīng)用配置好的Triton100-X打孔30min，含有PBS緩沖液的5%的山羊血清封閉1小時(shí)，漂洗充分后加入一抗（小鼠來源CtBP2，1∶200,abcam;兔來源GluA2,1∶200,milipore,CA;小 鼠 來 源 8-OHdG,1∶300,abcam）后4hC孵育一晚上，次日用PBS漂洗3遍，每次5min，隨后加入二抗（羊抗小鼠488抗體1∶300、羊抗兔 568 抗體 1∶300/羊抗小鼠 568 抗體 1∶300，abcam），毛細(xì)胞的纖毛染色染色時(shí)（anti-phalloidin），直接加入phalloidin 488抗體(1∶300，thermo)室溫避光孵育1h，隨后漂洗3次每次5min，用含DAPI的封片劑封片避光保存。

1.6 激光共聚焦顯微鏡

使用Leica正置共聚焦顯微鏡（TCS SP5 II;Leica Microsystems,Wetzlar,Germany），使用 63 倍油鏡，選擇405nm、488nm以及568nm波長的激發(fā)光對標(biāo)本進(jìn)行層掃，層厚0.35um/層，熒光激發(fā)下分別顯示藍(lán)色、綠色和紅色。以信號出現(xiàn)時(shí)開始層掃，以信號消失時(shí)結(jié)束，將所有圖片疊加后形成最終的結(jié)果圖片。

1.7 耳蝸帶狀突觸計(jì)數(shù)

在激光共聚焦顯微鏡下（63X），在中回上分別以三個(gè)內(nèi)毛細(xì)胞核為一個(gè)計(jì)數(shù)矩形視野，每個(gè)視野中將所有突觸標(biāo)記信號選中包括突觸前信號（紅）、突觸后信號（綠）和疊加信號（橙），三種信號總數(shù)計(jì)數(shù)信號分別除以3得到每個(gè)內(nèi)毛細(xì)胞平均突觸標(biāo)記物數(shù)量，每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選取5個(gè)視野，共計(jì)4個(gè)標(biāo)本（20個(gè)視野），最后統(tǒng)計(jì)出每組動(dòng)物帶狀突觸數(shù)量（均數(shù)i標(biāo)準(zhǔn)差）。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理，噪聲暴露前后各組ABR閾值總體比較采用單因素方差分析，各組組間比較采用Dunnet或LSD法檢驗(yàn)。帶狀突觸計(jì)數(shù)結(jié)果應(yīng)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較各時(shí)間點(diǎn)與暴露前的差別，P＜0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 聽功能檢測

2.1.1 6月齡小鼠聽功能檢測

本研究中噪聲暴露前小鼠ABR閾值（dB）分別為：37.5i 6.9（click）、50.0i 7.8（4K）、40.0i 5.5（8K）、72.5i 6.9（16K）和84.2i 4.9（24K）；噪聲暴露后1天，小鼠ABR閾值為54.2i 11.2（click）、65.8i 5.9（4K）、53.3i 9.3（8K）、85.0i 7.1（16K）和89.2i 2.1（24K），在各檢測頻率閾值均顯著上升（P＜0.05），且低頻聽力損失也較為嚴(yán)重(P＜0.01)；噪聲暴露后第7天，小鼠聽閾為50.0i 10.0（click）、64.2i 10.7（4k）、50.0i 10.2（8k）、80.0i 9.49（16K）和89.2i 2.1（24k），除16K頻率外其它頻率閾值仍顯著高于對照組（P＜0.05），表明此時(shí)聽力損害仍較嚴(yán)重；暴露后第14天，聽閾檢測結(jié)果為48.3i 6.8（click）、55.0i 4.8（4K）、48.7i 6.8（8K）、79.2i 9.7（16K）以及 88.2i 1.4（24K），此時(shí)click、8k以及24k頻率上ABR閾值仍顯著高于對照組（P＜0.05），而其它頻率的ABR閾值則和對照組無顯著性差異（P＞0.05），表明小鼠在暴露兩周僅有部分頻率的聽閾得到了恢復(fù)，見圖1A。

2.1.2 2月齡小鼠聽功能檢測

我們采用同等條件的噪聲對2月齡C57BL/6J小鼠進(jìn)行暴露，并分別在暴露前和暴露后1天、7天及14天檢測小鼠ABR閾值，結(jié)果如下：暴露前閾值為 17.2i 2.6（click）、35.0i 2.3（4K）、24.5i 2.4（8K）、26.7i 2.6（16K）、30.6i 3.6（24K）和53.0i 6.1（32K）；暴露后1天閾值23.2i 4.2（click）、40.4i 4.1（4K）、31.3i 4.5（8K）、32.3i 3.5（16K）、43.2i 7.8（24K）和68.3i 10.2（32K），低頻及高頻閾值上升顯著，但幅值較6月齡鼠?。槐┞逗?天僅有24K和32K存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其閾值為38.8i 4.1（24K）和64.6i 8.2（32K）；暴露后14天，小鼠各頻率閾值完全恢復(fù)（P＞0.05），見圖1B。

圖16 月齡和2月齡C57BL/6J小鼠在110dB噪聲暴露下ABR閾值變化Fig.1 Hearing detection after 110dB noise exposure in 6-month-old and 2-month-old C57BL/6J mice

2.2 帶狀突觸標(biāo)記及計(jì)數(shù)

為了進(jìn)一步觀察小鼠聽力損害的機(jī)制，我們對6月齡小鼠耳蝸毛細(xì)胞及耳蝸帶狀突觸進(jìn)行了免疫標(biāo)記和計(jì)數(shù)。此實(shí)驗(yàn)中，我們標(biāo)記了突觸前特異結(jié)構(gòu)RIBEYE/CtBP2（紅色熒光）和突觸后谷氨酸受體GluA2（綠色熒光），兩者疊加后的標(biāo)記物（呈現(xiàn)橙色）則代表了一個(gè)完整突觸結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)中完整突觸計(jì)數(shù)結(jié)果為12.4i 0.9/IHC（對照）、5.8i 1.8/IHC（P1）、7.6i 0.9/IHC（P7）和9.8i 1.0/IHC（P14）。結(jié)果表明暴露后1天突觸數(shù)量減少顯著（P＜0.01），P7的突觸數(shù)量有所增加；P14時(shí)盡管數(shù)量繼續(xù)增加，但仍少于對照組（P＜0.05），表明6月鼠齡C57小鼠在噪聲暴露14天后，其耳蝸帶狀數(shù)量仍不能完全恢復(fù)（圖2A&B）。為了比較6月齡和2月齡小鼠在聽功能受損程度上是否存在區(qū)別，我們對2月齡C57小鼠在同樣實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行了突觸數(shù)量計(jì)數(shù)。突觸數(shù)量分別為為16.4i 1.0/IHC（對照）、10.6i 1.6/IHC（P1）、13.7i 1.4/IHC（P7）和15.5i 1.4/IHC（P14），與6月齡小鼠相比，2月齡小鼠暴露后突觸數(shù)量恢復(fù)情況較6月齡鼠明顯，且P14時(shí)，2月齡小鼠耳蝸帶狀突觸數(shù)量和對照組相比無顯著差異（P＞0.05）。

圖2 6月及2月齡小鼠在110dB白噪聲暴露后耳蝸帶狀突觸數(shù)量變化Fig.2 Immunostaining detections of cochlear ribbon synapses in 6&2-month-old mice exposed to 110dB noise exposure.

2.3 110dB白噪聲暴露對耳蝸毛細(xì)胞線粒體損害觀察

本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，中等強(qiáng)度白噪聲暴露后6月齡C57小鼠耳蝸內(nèi)外毛細(xì)胞數(shù)量及排列未發(fā)生明顯變化。我們標(biāo)記了中回區(qū)域內(nèi)外毛細(xì)胞細(xì)胞核的數(shù)量和排列，以及進(jìn)行了毛細(xì)胞的纖毛染色，結(jié)果顯示三排外毛細(xì)胞和一排內(nèi)毛細(xì)胞排列整齊，無明顯缺失和錯(cuò)排，纖毛染色也十分完整，說明小鼠噪聲暴露后聽力下降并非是由于毛細(xì)胞丟失和纖毛受損導(dǎo)致的（圖3）。盡管在共聚焦顯微鏡觀察下在中回區(qū)域可見少數(shù)外毛細(xì)胞丟失情況，但此現(xiàn)象不足以導(dǎo)致聽力發(fā)生明顯損害。

前面的觀察已經(jīng)表明，此種噪聲暴露可以導(dǎo)致6月齡小鼠耳蝸帶狀突觸數(shù)量的減少，因而推測其可能是聽覺損害的發(fā)生原因。進(jìn)一步，我們試圖發(fā)現(xiàn)是什么導(dǎo)致了突觸減少呢？我們進(jìn)而對毛細(xì)胞內(nèi)的線粒體進(jìn)行了觀察，我們通過觀察8-OHdG染色變化情況來評估線粒體DNA的損傷情況。我們發(fā)現(xiàn)對照組幾乎看不到8-OHdG表達(dá)。而在噪聲暴露后1天、7天和14天，耳蝸內(nèi)、外毛細(xì)胞胞漿中8-OHdG染色均表現(xiàn)出較高水平。其中內(nèi)毛細(xì)胞的胞漿8-OHdG染色表達(dá)水平更高。即使在P14，內(nèi)外毛細(xì)胞仍可見較高的8-OHdG染色信號（圖3），此結(jié)果表明噪聲暴露導(dǎo)致的聽力損失與突觸損傷可能和耳蝸毛細(xì)胞線粒體DNA的損傷可能有關(guān)。

圖3 110dB白噪聲暴露對耳蝸內(nèi)外毛細(xì)胞、毛細(xì)胞纖毛及線粒體的影響Fig.3 Changes of cochlear OHCs,IHCs,hair cell cilia,and mitochondria DNAafter 110dB noise exposure.

3 討論

我們生活中存在很多環(huán)境噪聲，比如汽車、飛機(jī)和施工機(jī)械發(fā)出的聲響[6]。與高強(qiáng)度脈沖式噪聲不同，該中等偏強(qiáng)的噪聲頻率范圍較廣隱性危害較大[7,8]。很長的時(shí)間內(nèi)，其被認(rèn)為是安全的或者危害較小。然而近年來的研究表明，這種噪聲暴露依然可以對聽覺功能造成損害[9,10]。

本實(shí)驗(yàn)室之前的研究表明，此種白噪聲可以導(dǎo)致動(dòng)物出現(xiàn)暫時(shí)性閾移，經(jīng)歷這種類型噪聲暴露后動(dòng)物ABR閾值在暴露后數(shù)天一般可恢復(fù)[11,12]；同時(shí)小鼠耳蝸帶狀突觸數(shù)量也可以恢復(fù)[3，11]。本實(shí)驗(yàn)中上述結(jié)果再次得到驗(yàn)證。

然而在這種條件下，聽覺老化早期小鼠則顯示了不盡相同的聽力學(xué)表現(xiàn)：我們發(fā)現(xiàn)6月齡小鼠在暴露后2周ABR聽閾仍顯著高于對照組，說明此時(shí)小鼠的聽功能沒有完全恢復(fù)。而在石林等的研究中，小鼠鼠齡介于6-8周之間，這個(gè)范圍的小鼠較為年輕且聽覺系統(tǒng)發(fā)育已成熟，并且完全沒有出現(xiàn)年齡相關(guān)性聽力損失。說明聽覺系統(tǒng)發(fā)育成熟且較為年輕的小鼠對噪聲損害的代償能力較強(qiáng)，其升高的ABR閾值可以得到恢復(fù)。而處于聽覺老化早期的C57小鼠（6月鼠齡）對相同噪聲暴露的代償能力則顯著降低。進(jìn)一步，本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)6月齡小鼠低頻聽力下降較重而高頻聽力下降相對較輕，和Liberman實(shí)驗(yàn)室有區(qū)別，可能是由于本課題組采用的白噪聲覆蓋的頻率范圍廣，因而高頻區(qū)能量較低導(dǎo)致聽力損失程度較輕，而低頻區(qū)能量提高導(dǎo)致低頻聽力損失程度加重[14]。

很多研究表明，噪聲暴露后動(dòng)物耳蝸組織內(nèi)產(chǎn)生過量的自由基如活性氧自由基（Reactive oxygen species,ROS）。ROS可直接引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和DNA過氧化反應(yīng)，持續(xù)對細(xì)胞造成傷害，從而導(dǎo)致毛細(xì)胞功能狀態(tài)受損和聽力下降，甚至導(dǎo)致毛細(xì)胞凋亡[15,16]。線粒體是細(xì)胞內(nèi)能量代謝和ROS生成的主要場所[17]。噪聲暴露產(chǎn)生的ROS可攻擊線粒體DNA導(dǎo)致其突變，產(chǎn)生特異性的標(biāo)志物8-OHdG。我們的研究發(fā)現(xiàn)，噪聲暴露后，各組6月齡小鼠耳蝸內(nèi)外毛細(xì)胞均出現(xiàn)了明顯的8-OHdG表達(dá)升高，這表明了這種強(qiáng)度噪聲可以對耳蝸毛細(xì)胞線粒體造成損害。

本研究顯示噪聲暴露后CtBP2和GluA2數(shù)量明顯下降，而在中回區(qū)域內(nèi)未見內(nèi)外毛細(xì)胞明顯的大量丟失，盡管存在少量毛細(xì)胞缺失現(xiàn)象,但是這種缺失尚難以引起聽力的顯著損害，說明了本實(shí)驗(yàn)的噪聲通過損害耳蝸帶狀突觸進(jìn)而損害動(dòng)物聽力。我們發(fā)現(xiàn)6月齡鼠噪聲暴露后突觸數(shù)量不能完全恢復(fù)，同時(shí)6月鼠齡C57小鼠在突觸受損的同時(shí)發(fā)生了耳蝸毛細(xì)胞線粒體的損害。有研究表明,神經(jīng)細(xì)胞中約有1/3線粒體用來供給突觸活動(dòng)所需能量和維持突觸穩(wěn)定性[18]。本研究發(fā)現(xiàn)耳蝸大部分區(qū)域(頂中回)毛細(xì)胞數(shù)量和纖毛均無明顯變化，但是內(nèi)外毛細(xì)胞線粒體DNA受損（8-OHdG標(biāo)記物表達(dá)水平升高），可能是帶狀突觸的數(shù)量難以恢復(fù)的原因，同時(shí)線粒體供能下降和帶狀突觸的缺失可能是聽力難以恢復(fù)的原因。這些說明噪聲暴露可與聽覺老化作用相互疊加，使聽力損害程度顯著加重，以上結(jié)果可能揭示了噪聲對6月齡C57小鼠聽功能損害的分子機(jī)制。

總之，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)聽覺老化早期的6月齡C57小鼠對該110dB噪聲暴露更加敏感。盡管小鼠實(shí)驗(yàn)不能完全等同于人類的研究，但本研究仍對人類老年性聾具有重要的參考意義：對于那些已出現(xiàn)聽力損失的中老年人群，噪聲暴露仍具有一定的危險(xiǎn)性，此類人群也需要避免頻繁接觸噪聲環(huán)境，對于已經(jīng)發(fā)生了噪聲性聽力損害的中老年人則需要采取更加積極的治療措施。