金昊吳昊卓越洪文嘉鄭考唐霄雯鄭斌嬌*

1浙江省醫(yī)學遺傳學重點實驗室(溫州325035)

2溫州醫(yī)科大學Attardi線粒體生物醫(yī)學研究院(溫州325035)

1 基因表達譜相關技術

ISH是一項原始的基因表達譜技術，將特異探針與組織、細胞或染色體上目的核酸互補配對形成專一的核酸雜交分子，后經(jīng)一定的檢測手段將目的核酸的位置顯示出來。但是由于研究范圍的局限性，只能研究單個或小群體基因的表達，所以當高通量基因表達分析技術出現(xiàn)后迅速被取代。DNA微陣列技術通過小范圍內大量目的DNA與探針之間的雜化，可以快速準確地分析出靶向物整個轉錄組的基因表達水平，因此能識別出更多目的基因調控的潛在靶基因。

NGS的出現(xiàn)推動了不需要探針的新技術的發(fā)展，同時具備成本低、時間短和精度高等優(yōu)點?；虮磉_系列分析（serial analysis of gene expression，SAGE）技術將cDNA作為多連體進行切割和測序，產(chǎn)生獨特的表達序列標簽，從而近乎完整地獲得全基因組表達信息。轉錄組測序技術（RNA sequencing,RNA-Seq）是NGS的最新研究成果，它通過高通量測序技術檢測出轉錄組的表達水平，從而幫助認識目的基因的結構與功能。

第三代測序技術SMS不需要進行PCR擴增，主要有Helicos的單分子測序技術（ture single molecule sequencing,TSMS）、PacBio的單分子實時測序技術(single molecule real time,SMRT)和Oxford Nanopore的納米孔單分子測序技術（也有稱第四代測序技術）。前兩者的原理相同：通過熒光標記的脫氧核苷酸摻入目的DNA檢測，熒光基團一旦和DNA形成化學鍵即消失，因此不會影響目的DNA。納米孔單分子測序技術的核心是一塊由α-溶血素組成的并結合有核酸外切酶的納米孔道，靶向物穿過孔道時每一個堿基就會產(chǎn)生一個特異阻斷電流，由此獲得靶向物序列。目前，SMS仍在高速發(fā)展過程中，也許在未來幾年NGS主導的基因表達譜應用格局還會延續(xù)，但是完善的SMS平臺必將引領生物學界向更深層次發(fā)展。

2 基因表達譜對研究毛細胞再生的作用

毛細胞是聽覺感受器，在人體內數(shù)目不斷減少，但部分動物的毛細胞具有再生功能。Hawkins等利用適用于禽類橢圓囊和基底乳頭感覺上皮細胞的特異性探針檢測人的DNA序列，首次明確了禽類作為識別哺乳動物潛在耳聾位點的模型的作用[1]。在遺傳病變尚未明確時，可以通過這種方法識別一些未知的耳聾表達相關轉錄因子。Hawkins等分別用新霉素和激光消融處理毛細胞，研究禽類橢圓囊和基底乳頭的再生感覺上皮基因譜，發(fā)現(xiàn)許多保守的信號通路、細胞凋亡和細胞周期過程中與轉錄相關的基因在再生階段會受到不同程度的調控[2]。近年來也有研究者通過RNA-Seq分析幼雞橢圓囊以識別氨基糖甙類處理后毛細胞再生的轉錄組，共識別出約500個新的特異毛細胞基因以及超過200個處于再生階段的差異轉錄因子[3]。

斑馬魚是研究毛細胞再生的熱門模型。研究者使用NGS確定了受噪音損傷的成年斑馬魚的毛細胞再生基因調控網(wǎng)絡，發(fā)現(xiàn)stat3/socs3信號通路是這一過程中關鍵的調節(jié)器[4]。魚的側線器官中也存在毛細胞，因此也常被用于毛細胞再生研究。Bao等發(fā)現(xiàn)H3K27me3去甲基化酶受到抑制后，誘發(fā)毛細胞凋亡并降低其再生能力[5]。Mizutari等發(fā)現(xiàn)魚的Notch信號通路在毛細胞損傷后下調，提示哺乳動物和非哺乳動物之間的差異比較可能可以揭示毛細胞再生的潛在性[6]。

表1 特定內耳組織和細胞類型的基因譜相關技術Table 1 Gene prof i ling of specif i c tissues and cell types

3 基因表達譜對分析特定內耳組織和細胞類型的作用

明確特定組織和細胞層面的轉錄譜能全面地了解內耳分子功能，但是因為組織稀缺以及內耳細胞類型復雜等因素很難實現(xiàn)。Sajan等使用高精度的微陣列技術率先完成了對小鼠內耳從第9胚胎日到第15胚胎日分化過程的基因綜合分析，并且識別出50余種信號通路[7]。從此，基因譜技術由于其準確性和高效性而被廣泛用于特定內耳組織和細胞類型的研究（表1[8-16]）。Cristobal等首次將激光捕獲顯微切割技術應用在成年大鼠的壺腹嵴，發(fā)現(xiàn)了超過400種支持細胞和毛細胞的基因表達差異[13]。McDermott等通過將斑馬魚體內分離的毛細胞和肝臟的mRNA雜交，得到寡核苷酸DNA微陣列，識別出包括毛細胞轉錄組在內的超過1000個基因[14]。Kurima等分析發(fā)現(xiàn)在內耳感覺上皮優(yōu)勢表達的基因啟動子處，鋅指轉錄因子Zeb1結合位點發(fā)生變化，這可能是Zeb1小鼠突變體發(fā)育階段形成畸形內耳以及包括Zeb1結合位點在內的很多基因在突變體中出現(xiàn)異常的誘因[8,17]。另一項研究使用流式細胞熒光分選技術（f l uorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS）純化新生小鼠耳蝸的毛細胞和周圍非感覺群體，結果純化后的耳蝸支持細胞和小上皮嵴細胞增殖分化，說明它們的再生能力和周圍的毛細胞存在差異[9]。Lu等確定了FACS純化后從軸突延伸到螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的聽覺生成發(fā)展過程的完整表達譜，促進了特異性轉錄和軸突導向因子的識別[10]。Haraksingh等通過外顯子組測序技術和DNA微陣列技術對3個攜帶肌球蛋白重鏈7B（myosin heavy chain 7B，MYH7B）基因的耳聾家系進行研究，首次發(fā)現(xiàn)一個包含吡哆醛依賴性脫羧酶結構域含蛋白1（pyridoxal-dependent decarboxylase domain containing 1，PDXDC1）基因的染色體片段在患病家系成員中顯著缺失[18]。

4 基因表達譜對研究突變小鼠的作用

迄今為止基因譜技術最廣泛的應用之一就是通過小鼠突變體和野生型動物的比較分析來識別基因突變引起表達改變的潛在靶基因，闡明參與內耳發(fā)育、毛細胞再生和耳聾發(fā)病機理等不同過程的潛在分子機制。

Urness等將不會誘導內耳發(fā)育的成纖維細胞生長因子3（f i broblast growth factor,FGF3）和FGF10雙突變體作為研究內耳感應基因的一種模型，通過對耳區(qū)進行RNA ISH證明一些基底特定基因表達下調[19]。同時FGF3和FGF10的缺失也與后腦表達Wnt8的下調有關，這也使耳基板FGF的誘導形成與它對菱腦原節(jié)4或5-6節(jié)后部的限制之間建立聯(lián)系。Hertzano等首次對缺乏毛細胞存活所需轉錄因子Pou4f3的小鼠突變體內耳進行DNA微陣列分析，識別并確認了編碼轉錄阻遏蛋白的生長因子獨立因子1（growth factor independent factor 1,Gfi1）是Pou4f3的靶向物[20]。Matern等對Gfi1突變小鼠進行RNA-Seq檢測，顯示早發(fā)性聽力損傷和毛細胞再生功能缺陷[21]。Kammerer使用ISH發(fā)現(xiàn)癌胚抗原細胞粘附分子會導致哺乳動物聽覺上出現(xiàn)低、高頻率損傷[22]。Tekin等使用全基因組測序技術發(fā)現(xiàn)耳聾小鼠存在跨膜蛋白SLITRK6突變，提示其可能影響聽覺神經(jīng)在突觸的轉運過程[23]。

很多研究已經(jīng)通過小鼠突變體說明毛細胞基因表達缺失的后果。Libby等對攜帶肌球蛋白XV基因突變的shaker2突變小鼠進行了實驗，發(fā)現(xiàn)該突變導致毛細胞靜纖毛缺陷的同時引起耳聾[24]。缺少視網(wǎng)膜母細胞瘤基因（retinoblastoma gene,Rb1）的小鼠突變體耳蝸毛細胞受到損傷，但橢圓囊中的毛細胞不受影響[25]。一項DNA微陣列的比較分析顯示，Rb1突變耳蝸中參與Wnt和Notch信號通路的轉錄增加，而橢圓囊中細胞增殖和存活相關轉錄更為活躍[26]。胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factor 1,IGF-1）的缺失會導致人和小鼠耳聾，IGF-1突變小鼠耳蝸的基因譜顯示轉錄因子FoxM1、Six6和Mash1上調[27]?？p隙連接蛋白30（connexin 30,Cx30）的缺失會導致血管紋電位調控功能破壞并引起突變小鼠耳聾[28]。高半胱氨酸是內皮功能障礙的相關因子，也可作為支持血管紋的毛細血管屏障，Cx30突變體小鼠的DNA微陣列分析發(fā)現(xiàn)高半胱氨酸的增加[29]。

5 基因表達譜對認識年齡相關性聽覺喪失的作用

環(huán)境的改善和藥物水平的提高延長了人類的壽命，但是這也導致和年齡相關的感覺功能障礙在全世界范圍內呈現(xiàn)上升趨勢。老年性聾是最普遍的具有年齡特征的感覺功能障礙。最近一項研究比較了年齡相關性聽覺喪失的DBA/2J型小鼠在2個月和8個月時耳蝸基因的表達，發(fā)現(xiàn)大量8個月大的小鼠出現(xiàn)年齡相關性耳聾癥狀[30]。耳蝸的DNA微陣列分析顯示，這些小鼠身上出現(xiàn)的年齡相關性聾與耳蝸中調節(jié)線粒體呼吸鏈復合體的基因顯著下調有關。因為聽覺隨壽命不斷喪失，γ-氨基丁酸受體表達水平在CBA小鼠（一種人老年性耳聾的模型）中受到不同程度的調控。對該模型進行進一步研究發(fā)現(xiàn)細胞凋亡相關基因和抗氧化系統(tǒng)對老年性聾的影響[31]。Marano等報道了引起催乳素和生長激素強烈上調的年齡相關基因表達的變化[32]。另有研究表明缺少三葉因子3（trefoil factor 3,Tff3）肽的小鼠會遭受年齡相關的聽力喪失，DNA微陣列分析則顯示轉錄調節(jié)保全素Pttg1和蛋白酶抑制劑serpina3n能夠有效減弱這種損傷[33]。其他研究者也發(fā)現(xiàn)谷氨酸相關基因表達隨著年齡增長發(fā)生改變，提示其可能對年齡相關性聾產(chǎn)生影響[34-35]。

6 基因表達譜對了解內耳損傷調控機制的作用

內耳感音神經(jīng)功能可能因為直接病變、過度噪音干擾或者藥物干預造成損傷。對大鼠耳蝸的研究發(fā)現(xiàn)轉錄因子、細胞因子和氧化應激相關基因等基因在噪音暴露下數(shù)小時后表達上調的現(xiàn)象，持續(xù)受到損傷24小時后，抗氧化和炎癥的通路增加[36]。Cai等通過RNA-Seq獲得了小鼠免疫系統(tǒng)相關基因分子譜，發(fā)現(xiàn)噪音強度干擾了用于支持細胞的Toll樣受體信號通路的基因轉錄水平[37]。Park等在連續(xù)噪音損傷的小鼠模型中對半胱氨酰白三烯信號進行了檢測，觀察到半胱氨酰白三烯受體1型（cysteinyl leukotriene type 1 receptor,CysLTR1）在螺旋器中增多。在噪音損傷后使用白三烯受體拮抗劑（leukotriene receptor antagonist,LTRA）進行治療有效降低了毛細胞損傷，同時觀察到聽閾降低[38]。

體外形成的聽覺毛細胞需要NF-kappaB信號才能存活，NF-kappaB復合體還能參與細胞對有害刺激的免疫反應。Nagy等通過DNA微陣列探索此通路下游的轉錄變化，發(fā)現(xiàn)細胞內重要的信號傳導效應分子磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）調節(jié)亞基上調[39]。耳蝸中NF-kappaB抑制劑處理引起的PI3K通路障礙導致促凋亡基因Caspase-3的活化，揭示了毛細胞存活過程中各通路間的聯(lián)系。

7 基因表達譜對分析藥物影響的作用

抗利尿激素（anti-diuretic hormone,ADH）是由調控身體水含量的神經(jīng)垂體分泌的一種激素。通過基因表達譜分析，注射ADH對基因表達的影響得到證實。內淋巴液產(chǎn)量增加或吸收減少會導致水通道蛋白表達的變化，而水通道蛋白基因表達水平的改變也和老年性耳聾的形成有關[40]。

由于具有抗炎作用，地塞米松等糖皮質激素也被用于治療急性感覺神經(jīng)性聽力損失。在小鼠耳蝸中，地塞米松會對基因表達造成干擾，具有抗炎、細胞應激或防止氧化損傷的潛在細胞保護作用的基因表達也受到影響[41]。Takumi等將地塞米松作為豚鼠耳蝸移植物的一部分置于在地塞米松洗脫電極的環(huán)境中，再將正常電極和未處理的耳蝸基因譜進行比較，發(fā)現(xiàn)攜帶地塞米松洗脫電極的動物顯示出移植物引起的免疫反應相關基因下調的趨勢[42]。

高劑量的氨基糖甙類抗生素會誘導耳蝸毛細胞的凋亡。DNA微陣列分析慶大霉素處理后的大鼠外植體培養(yǎng)物，結果顯示由活性氧與N-甲基-D-天冬氨酸受體介導的細胞應激相關基因表達下調[43]。DNA微陣列分析顯示水楊酸注射3小時后小鼠耳蝸中87種基因表達上調，提示藥物水楊酸在使用時可能引起暫時性聽力損失或者耳鳴[44]。

8 展望

近些年來以DNA微陣列和NGS為基礎的基因譜研究持續(xù)發(fā)展，并已開發(fā)出第三代測序技術，廣泛應用于不同情況下組織或特定細胞類型的基因表達水平復雜性的分析。新的基因表達譜技術的發(fā)明不僅提供了快速獲取基因表達水平的簡單方法而且更加經(jīng)濟實惠。由于mRNA水平未必會對蛋白質表達水平產(chǎn)生影響，在翻譯后可能出現(xiàn)蛋白質磷酸化等進一步變化，因此蛋白質水平的變化必將成為下一個關注重點。通過熒光差異雙向電泳技術（2D-DIGE）、抗體DNA微陣列技術或液相色譜-質譜聯(lián)用技術可以對大型蛋白質組進行操作分析。一些相關的內耳研究已經(jīng)依靠這些技術在推進，例如毛細胞帶狀突觸蛋白質組和纖毛的確定以及耳蝸的耳毒性或噪音傷害的影響等。因此，未來的內耳研究很可能是以基因譜技術和蛋白質組學技術為基礎的基因分析組合，生物信息學工具的后續(xù)使用將根據(jù)單細胞分辨率實現(xiàn)對候選基因或潛在通路的快速識別，這些都將極大地推動內耳的相關研究。