張萍，周玉成，程悅寧，程世鵬，楊艷玲

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長春 130112）

熒光偏振（FP）由于其均勻的格式、速度、準(zhǔn)確性和自動(dòng)化的高通量能力，構(gòu)成了包括臨床、食品和環(huán)境[1-2]等各種應(yīng)用領(lǐng)域?qū)π》肿舆M(jìn)行常規(guī)分析的最有效的技術(shù)之一。熒光偏振免疫分析法（Fluorescen cepolarization immunoassay，F(xiàn)PIA）是基于對(duì)抗體結(jié)合位點(diǎn)的自由分析和熒光標(biāo)記抗原的競爭的一種方法，其操作簡單，易于自動(dòng)化，適于快速篩選。因?yàn)榉治鑫锟梢耘c高分子量的抗體結(jié)合，所以無需分離的步驟。目前，F(xiàn)PIA用于確定農(nóng)業(yè)產(chǎn)品和環(huán)境樣本中農(nóng)藥[3-4]、抗生素[5-7]和真菌毒素[8-9]的存在，且FPIA在病原檢測方面也已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用。筆者綜述了熒光偏振免疫技術(shù)的發(fā)展歷史、原理、優(yōu)缺點(diǎn)和在病原檢測中的應(yīng)用，概括了近幾年國內(nèi)、外針對(duì)各種病原建立的熒光偏振免疫分析方法研究進(jìn)展。

1 FPIA的發(fā)展歷史

在20世紀(jì)初期，Perrin最初建立了熒光偏振檢測方法。1954年，免疫分析就已成為臨床化學(xué)和生物化學(xué)等領(lǐng)域中的一個(gè)重要方法。雖然放射標(biāo)記免疫分析法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高和使用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，但放射危害以及標(biāo)記物不穩(wěn)定等缺點(diǎn)也很明顯。在此研究基礎(chǔ)上，陸續(xù)發(fā)展了酶免疫法、化學(xué)發(fā)光免疫法、熒光免疫法和電化學(xué)免疫法等免疫分析方法。這些方法在實(shí)際應(yīng)用中，大多數(shù)使用非均相的免疫分析技術(shù)。非均相系統(tǒng)靈敏度高且特異性好，但操作過程復(fù)雜繁瑣，受到限制。20世紀(jì)70年代，熒光偏振第一次應(yīng)用到抗原抗體反應(yīng)中，并用該法研究了生物系統(tǒng)中抗原-抗體和激素-受體之間的作用[10-11]。1976年，熒光偏振免疫方法首次應(yīng)用于篩選血清中的治療性藥物[12]。1977年，F(xiàn)PIA方法在檢測農(nóng)藥苯菌靈的主要代謝物2-氨基苯并咪唑中起到重要作用，但由于受到熒光偏振測量儀發(fā)展的限制，其應(yīng)用并不常見。20世紀(jì)80年代初，Jolley等[13-15]對(duì)FPIA方法進(jìn)行改良，并將FPIA方法用于人體治療藥物和毒物含量測定，檢測人血清中氨基糖苷類抗生素被認(rèn)為是FPIA方法在醫(yī)藥檢測應(yīng)用中的開端。1988年，Colbert等[16]首次將FPIA方法應(yīng)用在檢測農(nóng)藥殘留研究中，并且建立了檢測血液中百草枯含量的方法。Eremin等[17]建立了在豬肉中檢測磺胺二甲嘧啶殘留量的方法，并用該方法對(duì)食品中藥物殘留進(jìn)行檢測。而后，美國Jolley Consulting and Research公司推出更先進(jìn)的熒光偏振光分析儀，并具有易于自動(dòng)化、靈敏度高且可輸入多個(gè)參數(shù)等優(yōu)點(diǎn)。Baker等[18]在2000年設(shè)計(jì)了雙光路熒光偏振光分析儀，可以消除背景干擾，在測定復(fù)雜生物樣品時(shí)，具有更好的靈敏度和精確度。

2 FPIA的原理

熒光偏振免疫分析與傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）相比，最顯著優(yōu)勢在于它是在液相中進(jìn)行的一種均相分析，無需分離游離和結(jié)合的示蹤物，省略了洗滌步驟。當(dāng)溶液中的熒光基團(tuán)暴露于平面偏振光下，產(chǎn)生的輻射就會(huì)被極化。在激發(fā)和發(fā)射過程中，熒光體的運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生了反極化的結(jié)果，因此，熒光基團(tuán)的運(yùn)動(dòng)速度越快，發(fā)射角度越偏，使用偏振器可以將熒光發(fā)射分離成水平和垂直分量。

在最簡單的意義上，偏振（P）可以表達(dá)為垂直（IV）和水平（IH）平面上的發(fā)射差除以它們的總和，即P=（IV-IH）/（IV+IH）。在沒有待測因素影響情況下，抗體結(jié)合示蹤物，限制了其運(yùn)動(dòng)，偏振值較高。在待測樣品存在情況下，示蹤物與抗體結(jié)合少，大部分存在于溶液中，其偏振值較低。許多學(xué)者曾對(duì)這種分析原理多次進(jìn)行詳細(xì)的描述[19-21]。

3 FPIA方法的優(yōu)缺點(diǎn)

3.1 FPIA的優(yōu)點(diǎn)

無需洗滌操作，減少試劑用量；檢測迅速，易于自動(dòng)化，便于快速篩選；熒光標(biāo)記抗原均一性好，穩(wěn)定性高；不易受溶液顏色和儀器靈敏度變化等因素的影響，結(jié)果穩(wěn)定。

3.2 FPIA的缺點(diǎn)

靈敏度比ELISA方法低；易受背景熒光、光散射以及樣本基質(zhì)的影響；檢測范圍較窄，信噪比（S/N）較低；純化步驟復(fù)雜；需要特定的分析儀器，價(jià)格昂貴[22]。

4 FPIA研究進(jìn)展

4.1 單試劑FPIA檢測方法

單試劑FPIA檢測方法是抗原抗體與選定的示蹤物混合，進(jìn)行競爭性抗原反應(yīng)，將傳統(tǒng)的FPIA方法操作步驟進(jìn)行簡化，孵育時(shí)間短，便于操作和運(yùn)輸。由于示蹤物對(duì)抗體具有一定的保護(hù)作用，所以，單試劑FPIA比普通FPIA更加穩(wěn)定[23]。

4.2 停流FPIA方法

當(dāng)樣品中病原含量較低時(shí)，競爭免疫系統(tǒng)達(dá)到平衡，難以區(qū)別分析信號(hào)和本地信號(hào)。停流FPIA技術(shù)測量示蹤物與抗體起始反應(yīng)速度，大大降低了散射光和基質(zhì)熒光對(duì)檢測結(jié)果的影響，且反應(yīng)測量速度快，僅需要 4～6 s。

4.3 置換FPIA方法

置換FPIA技術(shù)是將示蹤物與抗體提前在溶液中進(jìn)行平衡，然后與樣品結(jié)合，抗原將溶液中的示蹤物與抗體結(jié)合物中的示蹤物置換出，測定置換出的示蹤物，換算樣品中的抗原濃度，無需孵育便可檢測，檢測時(shí)間短，反應(yīng)過程較為穩(wěn)定，標(biāo)準(zhǔn)曲線在7 d內(nèi)穩(wěn)定[23]。

4.4 有機(jī)溶劑FPIA方法

在非極性有機(jī)溶劑中，表面活性劑形成的反相膠束系統(tǒng)可以溶解多種生物活性物質(zhì)，形成透明膠狀溶液。反相膠束系統(tǒng)的優(yōu)勢是可以測定非極性有機(jī)溶劑中的分析物。在分析動(dòng)植物組織中的藥物殘留時(shí)，用可與水混溶的有機(jī)溶劑直接提取三氯乙醛[24]、2，4，5-三氯苯氧乙酸和甲基對(duì)硫磷[9]等藥物；另外，F(xiàn)PIA反應(yīng)中至少可耐受25%的甲醇或者10%乙腈，而在檢測赭曲霉素A時(shí)，即使甲醇含量100%，靈敏度也不會(huì)發(fā)生很大變化[25]。

4.5 芯片F(xiàn)PIA方法

微芯片分析是一種很有前景的藥物治療監(jiān)測方法。它是在微晶片上測定熒光偏振，并獲得血清素的濃度。Tachi等[25]成功地對(duì)血清中血清素進(jìn)行了定量分析，在65s內(nèi)可分析出結(jié)果；微芯片F(xiàn)PIA方法取得的結(jié)果與克隆酶免疫分析（CEDIA）和顆粒增強(qiáng)濁度抑制免疫分析（PETINIA）的結(jié)果有良好的相關(guān)性。傳統(tǒng)FPIA是用于分析各種藥物的通用方法，基于微芯片的FPIA系統(tǒng)不僅用于植物的分析，還可用于其他藥物的分析。

5 熒光偏振免疫技術(shù)在病原檢測中的應(yīng)用

5.1 在布魯氏菌檢測中的應(yīng)用

1996年，已經(jīng)出現(xiàn)將FPIA與其他血清學(xué)方法結(jié)合檢測牛布魯氏菌的案例。將經(jīng)過平板凝集試驗(yàn)（BPAT）、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CFT）、間接酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（IELISA）和競爭性酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（CELISA）檢測過的9 480份血清樣品進(jìn)行了FPIA試驗(yàn)。這些血清中，有561份樣品是從檢測出布魯氏菌的組織和牛奶中分離出來的，8669份來自流行病學(xué)和血清學(xué)檢測均為陰性的牛，250份來自免疫后不同時(shí)期的牛。當(dāng)隔斷值（Cut-off值）為90 mP時(shí)，F(xiàn)PIA的敏感性和特異性分別是99.02%、99.96%，均高于其他傳統(tǒng)檢測方法[26]。2014年，訾占超等[27]闡述了熒光偏振技術(shù)在布魯氏菌病檢測中的應(yīng)用并進(jìn)行了分析。

5.2 在真菌毒素檢測中的應(yīng)用

5.2.1 伏馬菌素 伏馬菌素是發(fā)現(xiàn)于多種商品中的霉菌毒素，包括玉米等，被認(rèn)為是豬肺水腫綜合癥和馬腦白質(zhì)軟化綜合癥的致病因子。試驗(yàn)證明，伏馬毒素對(duì)嚙齒類動(dòng)物也有致癌作用。第一個(gè)報(bào)道霉菌毒素的FPIA應(yīng)用是用于檢測玉米中的伏馬菌素[28]?？蒲腥藛T對(duì)2種數(shù)據(jù)的采集和分析方法進(jìn)行研究：一種是在添加示蹤劑之前收集樣品（IV，IH）的熒光強(qiáng)度，隨后用于校正添加示蹤劑后獲得的值，通過這種方式，每個(gè)樣本都確定了其背景校正，再將樣品的結(jié)果與緩沖液的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比；另一種是利用緩沖溶液的熒光強(qiáng)度來校正樣本的背景熒光，在這種方法中，將試驗(yàn)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，最大值為1，最小值為0，將樣品的數(shù)據(jù)與緩沖液的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比，確定伏馬菌素的含量，不包括提取步驟，分析大約需要2min。玉米樣品檢測范圍為0.5～20.0g FB1/g，平均回收率為94.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為14.6%。第1種方法的校正背景較好，所以性能方面更有優(yōu)勢。

5.2.2 黃曲霉毒素 黃曲霉毒素作為致癌物，與人類和動(dòng)物健康的相關(guān)性低于其他的真菌毒素，而且這些毒素在食物和飼料中的含量也較低。因此，這些毒素的檢測方法需要較高的靈敏度。已有報(bào)道關(guān)于天然受污染的玉米、高粱、花生糊和花生醬中黃曲霉素敏感的FPIA，示蹤劑是黃曲霉毒素?zé)晒馑嘏悸?lián)物，孵育時(shí)間為15min。黃曲霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液中，黃曲霉素B1、B2、G1和G2的抑制曲線的中點(diǎn)分別為28、90、100和100ng/mL；該試驗(yàn)與高效液相色譜（HPLC）的參考方法相比較，顯示出天然受污染樣品的良好相關(guān)系數(shù)（r2=0.97），盡管在爆米花中存在偏差[29]。

5.2.3 玉米赤霉烯酮 玉米赤霉烯酮（ZEN）及其一些同源物質(zhì)都是雌性激素，通常由產(chǎn)生脫氧雪腐的同種真菌產(chǎn)生。FPIA最初用來檢測玉米赤霉烯酮和玉米相關(guān)化合物[30]，使用ZEN-熒光素示蹤劑。該方法檢測限為0.1g ZEN/g玉米，說明試驗(yàn)的效果與示蹤劑孵育的時(shí)長短有關(guān)。該方法與HPLC相比較，相關(guān)系數(shù)（r2）為0.976。為建立一種敏感的FPIA來篩選玉米中玉米赤霉烯酮一類的真菌毒素，制備2種新的單克隆抗體（MAbs），與玉米烯酮類和4種熒光標(biāo)記示蹤劑密切相關(guān)。在靈敏度和特異性方面選擇適當(dāng)?shù)淖粉櫩贵w后，建立一種能夠檢測出玉米烯酮類且具有相似靈敏度的FPIA。

6 結(jié)論

應(yīng)用FPIA對(duì)各種病原分析的技術(shù)越來越多。據(jù)報(bào)道，F(xiàn)PIA的速度確實(shí)非?？?，大多數(shù)需要2～15 min即可完成。重要的試驗(yàn)參數(shù)，如速度和靈敏度，不僅取決于抗體和示蹤劑的質(zhì)量，還取決于它們?nèi)绾闻c病原相互作用。選擇合適的抗體和示蹤劑組合可以產(chǎn)生快速而敏感的抗原。像其他免疫系統(tǒng)一樣，F(xiàn)PIA會(huì)受到樣本矩陣的影響。除了使用最靈敏的抗體和示蹤劑組合外，矩陣效應(yīng)還可以通過一系列確定的程序來控制，從簡單的稀釋到與矩陣匹配的校準(zhǔn)。雖然FPIA非常簡單，但技術(shù)的邏輯進(jìn)展可使分析步驟自動(dòng)化，以進(jìn)一步提高易用性，減少與操作相關(guān)的變量使用，隨著FPIA技術(shù)不斷進(jìn)步，F(xiàn)PIA檢測方法可能會(huì)成為各種病原檢測的主要技術(shù)之一。