楊凌君， 葉 玲， 趙奕敏， 梁秀婷， 駱文俊， 王琤韋華*

（江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西南昌 330013）

沙門(mén)氏菌（Salmonella）是一種常見(jiàn)的人畜共患病原菌，對(duì)人和動(dòng)物的危害極大 （吳荔琴等，2017）。感染沙門(mén)氏菌后會(huì)加劇發(fā)病率或死亡率，降低動(dòng)物的繁殖生產(chǎn)力。沙門(mén)氏菌容易污染食物，對(duì)食品安全構(gòu)成威脅 （Vivek等，2015；何曉芳，2013），因此有必要?jiǎng)?chuàng)建一種快速準(zhǔn)確的沙門(mén)氏菌檢測(cè)方法。本文綜述了沙門(mén)氏菌的特征以及迅速檢測(cè)沙門(mén)氏菌的方法，以期為沙門(mén)氏菌的迅速檢測(cè)提供理論依據(jù)。

1 沙門(mén)氏菌概述

沙門(mén)氏菌屬作為腸桿菌科的一個(gè)大屬，是一種重要的革蘭氏陰性食源性致病菌，在自然界分布廣泛，種類繁多（朱奇等，2015）。食用被沙門(mén)氏菌污染的水和食物后，在宿主體內(nèi)可以引起腸道系統(tǒng)疾?。╓an 等，2017；Gong 等，2017）。 沙門(mén)氏菌屬根據(jù)細(xì)菌抗原分為四十二個(gè)群和兩千多種血清型，主要致病菌是A～E群的某些菌株（黃敏，2017）。通常情況下沙門(mén)氏菌使用量超過(guò)105cfu即可造成人類感染，而對(duì)于高度易感染人群15～20 cfu即可引起沙門(mén)氏菌感染 （Kokkinos等，2014）。蛋和肉類是沙門(mén)氏菌的主要載體。通過(guò)對(duì)沙門(mén)氏菌多方面的研究，可以提高禽蛋和肉類產(chǎn)品的食用安全指數(shù)。

2 沙門(mén)氏菌的特征

2.1 理化特征 沙門(mén)氏菌具有復(fù)雜的抗原結(jié)構(gòu)，一般沙門(mén)氏菌具有菌體（O）抗原、鞭毛（H）抗原和表面抗原 （莢膜或包膜抗原）三種抗原。竇雪如（2016）通過(guò)對(duì)沙門(mén)氏菌的質(zhì)量控制考核得出，沙門(mén)氏菌的三種抗原中，H抗原是蛋白質(zhì)，不耐熱，存在于鞭毛中，由鞭毛素組成，而鞭毛素中氨基酸不同的排列組合，決定著H抗原的特異性。胡麗君（2017）通過(guò)對(duì)147株腸炎沙門(mén)氏菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌和海德?tīng)柋ど抽T(mén)氏菌進(jìn)行全基因組測(cè)序，對(duì)比分析三種菌株攜帶的耐藥基因發(fā)現(xiàn)，不同血清型及不同來(lái)源的耐藥菌株攜帶的耐藥基因不同。申永秀等（2018）對(duì)來(lái)源于人和動(dòng)物的261株沙門(mén)氏菌進(jìn)行血清分型，對(duì)15種抗生素進(jìn)行藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，多重耐藥性菌株較多，且人源與動(dòng)物源菌株間耐藥特征存在明顯的相關(guān)性。

2.2 致病性 沙門(mén)氏菌屬有的對(duì)人類致病，有的只對(duì)動(dòng)物致病，也有的對(duì)人和動(dòng)物都致病。關(guān)紅等（2014）發(fā)現(xiàn)，從內(nèi)蒙古地區(qū)奶牛乳房炎和子宮內(nèi)膜炎病料中分離到的沙門(mén)氏菌能夠引起小鼠發(fā)病，且致病力較強(qiáng)。蔡雙雙等（2014）將分離鑒定得到的鴨源鼠傷寒沙門(mén)氏菌分為HP-2和HP-3株，用HP-2感染的小鼠全部死亡，有60%經(jīng)皮下注射途徑所感染的13日齡雛鴨死亡。隋明等（2018）通過(guò)從都江堰地區(qū)的53份冷鮮肉食品樣品中檢測(cè)出30株沙門(mén)氏菌分離株，其中24株沙門(mén)氏菌為致病性菌株，證實(shí)該地區(qū)冷鮮肉食品中沙門(mén)氏菌污染很嚴(yán)重，均具有很強(qiáng)的致病性。

2.3 耐藥性 由于抗生素的大量使用，近年來(lái)全世界面臨耐藥菌株加速出現(xiàn)等嚴(yán)重問(wèn)題 （葛林，2018）。如沙門(mén)氏菌不僅耐藥率呈現(xiàn)出逐年上漲的趨勢(shì)，而且還產(chǎn)生了嚴(yán)重的多重耐藥性，很多經(jīng)常使用的抗生素藥效明顯降低乃至無(wú)效（刑艷萍等，2010）。廖成水等（2011）用雞肉中的98株沙門(mén)氏菌對(duì)22種藥物敏感性進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，高達(dá)96.94%的沙門(mén)氏菌的抗藥力為三倍或者更高，而56.12%菌株的耐藥性高于七倍，最耐藥的菌株至多可以耐受18種抗生素。武運(yùn)等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，17株腸炎沙門(mén)氏菌與11株哈瓦那沙門(mén)氏菌對(duì)經(jīng)常使用的抗生素藥物的耐藥性比較嚴(yán)重。林亞軍等（2018）選取瓊脂稀釋法對(duì)39株分散寵物源沙門(mén)氏菌進(jìn)行敏感性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，39株寵物源沙門(mén)氏菌對(duì)至少六種抗菌藥都有抗藥性，高達(dá)97.4%的菌株對(duì)環(huán)丙沙星和阿莫西林具有抗藥性。鐘舒紅等（2018）利用K-B紙片法分散和測(cè)定沙門(mén)氏菌及他的血清型，并且使用24種抗菌藥物對(duì)隨機(jī)選取的80株分離株開(kāi)始了敏感性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，100%沙門(mén)氏菌分離株具有多重耐藥性，而有78.75%的分離株具有高達(dá)10～16重耐藥。隨著沙門(mén)氏菌耐藥性增強(qiáng)，合理使用抗生素以及研發(fā)新的抗菌劑成為治療沙門(mén)氏菌相關(guān)疾病的關(guān)鍵。

2.4 受有機(jī)酸的抑制作用 有機(jī)酸以未分離分子的方式存在時(shí)，其可以穿透細(xì)胞壁，攪亂“pH敏感細(xì)菌”的一般生理，作用結(jié)果和抗生素十分相似（Thompson 等，1997）。 趙建芳等（2017）研究酢漿草的乙醇溶液和水溶液的提取物對(duì)4種細(xì)菌和1種真菌的抑制效果發(fā)現(xiàn)，酢漿草乙醇提取物對(duì)沙門(mén)氏菌和大腸桿菌有著很強(qiáng)的抑制效果。趙景鵬等（2018）通過(guò)對(duì)肉仔雞飼喂不同有機(jī)酸與精油組合發(fā)現(xiàn)，丁酸與其他精油組分對(duì)腸炎沙門(mén)氏菌具有協(xié)同抑制功效?；谏抽T(mén)氏菌受到有機(jī)酸抑制作用這一現(xiàn)象，喂養(yǎng)禽類添加能較強(qiáng)抑制沙門(mén)氏菌的有機(jī)酸與其他物質(zhì)的混合物，可以從源頭上降低沙門(mén)氏菌對(duì)禽類以及禽蛋的感染，減少因食用被沙門(mén)氏菌感染的肉類以及蛋類而引起的食物中毒現(xiàn)象。

2.5 低溫控制生長(zhǎng) 環(huán)境因素是影響沙門(mén)氏菌消長(zhǎng)的重要因子之一，其中，溫度變化是影響沙門(mén)氏菌生長(zhǎng)的主要因素 （Huang，2003）。趙格等（2016）發(fā)現(xiàn)，蛋殼完整的雞蛋受到致病菌的污染，可以在室溫下或冷藏環(huán)境中以清潔的方式貯存1個(gè)月，然而，在較高的溫度下，病原體會(huì)在第20天侵入卵。沈?qū)W懷等（2016）經(jīng)過(guò)在雞蛋殼表面人為的接種三種有差別的沙門(mén)氏菌，在不同的環(huán)境中儲(chǔ)藏，發(fā)現(xiàn)較低溫度和較低濕度條件能夠減少蛋殼表面沙門(mén)氏菌的生存時(shí)間。溫杰鋒等（2017）發(fā)現(xiàn)，在夏秋冬三季，卵殼和卵白的沙門(mén)氏菌感染率呈下降的趨勢(shì)，而且夏季感染率遠(yuǎn)高于秋冬。

3 沙門(mén)氏菌快速檢測(cè)方法

3.1 免疫學(xué)方法

3.1.1 熒光免疫技術(shù)（IFT） 熒光法是利用Uio-66-NH2的熒光猝滅特征和核酸適配體的吸附性，創(chuàng)建了熒光生物傳感器用于沙門(mén)氏菌的檢測(cè)，當(dāng)改性的沙門(mén)氏菌和合適的適配體被原料吸附到表面時(shí)，沙門(mén)氏菌及其適配體會(huì)被特別束縛并從材料表面上移除，材料與熒光素之間的電子轉(zhuǎn)移過(guò)程被割斷，熒光素的熒光恢復(fù)（蔣曉華等，2018）。Wen等（2013）利用免疫磁球微球和免疫熒光微球結(jié)合沙門(mén)氏菌，可直接在熒光顯微鏡下檢測(cè)夾心免疫復(fù)合物，并用熒光光譜儀進(jìn)行定量，該方法適用于105～107cfu/mL線性范圍內(nèi)，最低檢測(cè)限值為10 cfu/mL。Wang等（2014）用高熒光強(qiáng)度和高水溶性的CdTe量子點(diǎn)當(dāng)成熒光標(biāo)識(shí)物，創(chuàng)建了檢測(cè)蛋殼上的沙門(mén)氏菌免疫光的高度特異性方法，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌液體濃度與熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)出良好線性關(guān)系的沙門(mén)氏菌濃度為3×102～3×107cfu/mL。Pandey等（2014）應(yīng)用了一個(gè)新的基于Vi莢膜多糖檢測(cè)的夾心熒光免疫分析法，使用陽(yáng)離子受體分子多粘菌素B作為黏結(jié)劑而抗Vi抗體作為捕集劑，以堿性磷酸鹽標(biāo)記二抗，對(duì)硝基苯酚磷酸鹽為顯示底物，特異性檢測(cè)傷寒沙門(mén)氏菌，檢測(cè)限為10 cfu/mL。熒光免疫技術(shù)在檢測(cè)過(guò)程當(dāng)中比傳統(tǒng)方法更快、更簡(jiǎn)單、更靈敏。然而熒光免疫技術(shù)的結(jié)果鑒定存在主觀性和非特異性染色的問(wèn)題，并且操作環(huán)節(jié)也比較復(fù)雜。

3.1.2 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定方法（ELISA） 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定方法是利用在抗原和抗體之間產(chǎn)生的固相化和酶標(biāo)記。Kumar等（2008）選用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定方法檢測(cè)傷寒沙門(mén)氏菌。Bang等（2012）創(chuàng)立間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定方法用于檢測(cè)鼠傷寒沙門(mén)氏菌。張帥等（2016）創(chuàng)建雙抗夾心酶聯(lián)免疫系統(tǒng)的基礎(chǔ)是吸附多抗體當(dāng)作96孔酶標(biāo)記的抗體，并利用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記單抗體，檢查到模仿被污染的肉類中沙門(mén)氏菌的上限是800 cfu/g，與其余的血清類沙門(mén)氏菌沒(méi)有交叉反應(yīng)，特異性較好。李珊珊等（2018）創(chuàng)建C2和C3亞群沙門(mén)氏菌的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定方法，結(jié)果表明對(duì)沙門(mén)氏菌C2亞群的兩種菌株以及C3亞群的一種菌株的最低檢出值都能夠到達(dá)105cfu/mL，且用于鑒定特異性的其他沙門(mén)氏菌和非沙門(mén)氏菌在濃度為108cfu/mL時(shí)無(wú)交叉反應(yīng)。ELISA方法具有使用方便、檢測(cè)迅速、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。然而該方法檢出抗體的持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，更符合抗體消長(zhǎng)規(guī)律。

3.2 分子生物學(xué)方法

3.2.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法（PCR） PCR方法是Kary Mullis在1985年建立的一種能夠在體外進(jìn)行基因擴(kuò)增的方法 ，該方法能夠快速在體外進(jìn)行擴(kuò)增目標(biāo)基因的DNA片段，達(dá)到檢測(cè)所需的檢測(cè)量（張萍，2015）。 Jacobsen 等（2007）研究表明，熒光定量PCR不能有效區(qū)分死菌和活菌，所以熒光定量PCR方法不適用于檢測(cè)加熱致死的菌體樣品。Bakthavathsalam等（2013）利用IMS實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)牛奶與檸檬汁中的沙門(mén)氏菌，3～4 h內(nèi)可檢測(cè)103cfu/mL的沙門(mén)氏菌。Zheng等（2014）創(chuàng)建的PCR-IMS技術(shù)是用熒光定量PCR和免疫磁珠分離共同結(jié)合而成，分別經(jīng)過(guò)7 h和14 h的增菌后可檢測(cè)鴨翅中101～100cfu/25g正常的沙門(mén)氏菌和熱受損的沙門(mén)氏菌。王青龍等 （2018）根據(jù)GenBank公布的亞利桑那沙門(mén)氏菌和其他沙門(mén)氏菌gud D基因序列，研究了Taqman探針和引物對(duì)沙門(mén)氏菌進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR特異性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)相同，擁有檢測(cè)周期短、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，其中靈敏度試驗(yàn)可以達(dá)到1～10 cfu/mL。熒光定量PCR方法不適合檢測(cè)熱誘導(dǎo)細(xì)菌樣品，可是結(jié)合熒光定量PCR和免疫磁珠分離技術(shù)可以檢測(cè)出熱損傷的沙門(mén)氏菌。

3.2.2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) （LAMP） LAMP技術(shù)是一種新式的核酸擴(kuò)增技術(shù)，其在60～65℃的恒溫前提下將目標(biāo)序列擴(kuò)大到109水平（王羽，2010；Nomomi等，2000）。 LAMP 技術(shù)與 PCR 擴(kuò)增技術(shù)相比，它的靈敏度、檢測(cè)限度和特異性均能滿足檢測(cè)目標(biāo)，而且LAMP技術(shù)優(yōu)于PCR技術(shù)（Tomita 等，2008）。 Ravan 等（2012）利用 prt基因當(dāng)作沙門(mén)氏菌D血清群的靶基因，對(duì)5個(gè)沙門(mén)氏菌D群和4個(gè)其余的沙門(mén)氏菌血清群進(jìn)行了特異性檢出。Chayapa等（2012）創(chuàng)立了腸炎沙門(mén)氏菌的RT-LAMP檢測(cè)技術(shù)，通過(guò)濃縮培育16 h后，純細(xì)菌的檢測(cè)范圍包括使用DNA酶處理及沒(méi)有使用DNA酶處理的分別為100cfu/mL和101cfu/mL。Zhuang等（2014）利用bcf D基因建立的LAMP檢測(cè)限為5×100，反應(yīng)時(shí)間為25 min。王瑾等（2016）根據(jù)沙門(mén)氏菌的inv A基因序列研制了一種利用米氏綠熒光染料檢測(cè)沙門(mén)氏菌的新的LAMP技術(shù)，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)總過(guò)程只需45 min，靈敏度達(dá)到6 cfu/管，而且經(jīng)過(guò)模仿人為污染的25 g沙門(mén)氏菌的雞肉樣品，在37℃完成了用來(lái)檢測(cè)樣品中的實(shí)時(shí)熒光定量環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的DNA模板，發(fā)現(xiàn)靈敏度到達(dá)450 cfu/g，一共大約耗時(shí)7 h。LAMP技術(shù)擁有特異性高、敏感性高、簡(jiǎn)單、方便和成本低的特征，但在檢測(cè)過(guò)程中容易污染，造成假陽(yáng)性。

3.2.3 探針?lè)椒?檢測(cè)沙門(mén)氏菌探針?lè)椒ǖ脑硎菍⒓{米粒子與數(shù)百個(gè)量子點(diǎn)連接起來(lái)，制備用于信號(hào)放大的顯示探針，并且使用親和性和生物素的特異性結(jié)合原理，制備能捕捉到沙門(mén)氏菌DNA熒光強(qiáng)度的探針。Cremonesi等（2014）利用Taq Man熒光探針建立實(shí)時(shí)PCR對(duì)沙門(mén)氏菌進(jìn)行檢測(cè)，靈敏度達(dá)1 pg基因組DNA，相當(dāng)于1 cfu/mL。謝同彬等（2017）通過(guò)制備CdTe量子點(diǎn)-納米金顯示探針與磁性納米粒子捕獲探針結(jié)合成的復(fù)合納米探針對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，沙門(mén)氏菌為10～1000 fmol/L時(shí)，其DNA濃度與熒光強(qiáng)度展現(xiàn)出較好的線性關(guān)系，檢出上限為8 fmol/L，最低限值為4 fmol/L。探針?lè)椒ň哂忻舾?、特異、?jiǎn)便、快速的特點(diǎn)。

3.2.4 LAMP微流控芯片技術(shù) LAMP微流控芯片技術(shù)是用于沙門(mén)氏菌等食源性病原體的一種將LAMP技術(shù)與微流控芯片技術(shù)相結(jié)合的技術(shù)。微流控技術(shù)經(jīng)過(guò)化學(xué)分析設(shè)備的小型化和集成，最大限度地將分析實(shí)驗(yàn)室的作用集成到芯片中（Jokerst等，2012）。LAMP微流控芯片技術(shù)集成了LAMP反應(yīng)系統(tǒng)在芯片上。鞠鶴鵬等（2018）通過(guò)設(shè)計(jì)LAMP引物與微流控芯片制作成用來(lái)檢測(cè)三種致病菌的LAMP微流控芯片，其中這三種致病菌分別為沙門(mén)氏菌、大腸桿菌O157和金黃色葡萄球菌，發(fā)現(xiàn)制作好的LAMP微流控芯片擁有良好的特異性，三種致病菌的檢測(cè)靈敏度都可以到達(dá)100 cfu/mL，可以用在食源性致病菌的迅速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方面。LAMP微流控芯片技術(shù)具有體積小、分析速度快、樣品和試劑用量少等優(yōu)點(diǎn)，然而試驗(yàn)結(jié)果中易出現(xiàn)假陽(yáng)性，降低了試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

4 結(jié)語(yǔ)

目前，已經(jīng)有很多快速檢測(cè)沙門(mén)氏菌的技術(shù)，但在實(shí)踐中，大多數(shù)技術(shù)都存在著操作環(huán)節(jié)復(fù)雜、耗時(shí)多、靈敏度低等部分缺點(diǎn)。而探針?lè)椒▍s具有敏感、特異、簡(jiǎn)便、快速的特點(diǎn)。由于沙門(mén)氏菌引起的食源性疾病較為嚴(yán)重，其檢驗(yàn)技術(shù)始終受到人們的重視，因此有必要研究出一種更簡(jiǎn)便、靈敏度更高、耗時(shí)更短、花費(fèi)更少的檢測(cè)方法，預(yù)防沙門(mén)氏菌的污染。