牛佳偉，魏杰

（1.山西醫(yī)科大學，山西 太原 030001；2.山西醫(yī)科大學附屬人民醫(yī)院 骨科，山西 太原 030001）

隨著現(xiàn)代城市化進程的發(fā)展及我國老齡化的到來，骨折的發(fā)生率不斷攀升。在這些骨折中發(fā)生骨折延遲愈合或者不愈合占5%～10%，導致患者的康復周期延長從而增加患者家庭的經(jīng)濟負擔以及造成社會資源的浪費[1]，因此進一步了解骨折愈合的機制對于將來研究骨折不愈合的預防及治療至關(guān)重要。

骨折愈合過程大體分為骨折血腫炎癥機化期、原始骨痂形成期和骨痂改造塑型期。這3 個過程的任一階段的異常都會影響骨折的愈合從而導致骨折延遲愈合或者不愈合。骨折血腫炎癥機化期，創(chuàng)傷導致局部組織腫脹釋放細胞因子白細胞介素-3（Interleukin,IL-3）、白細胞介素-4（IL-4）、腫瘤壞死因子-α （tumor necrosis factor,TNF-α）等誘發(fā)局部炎癥反應[2]。隨著炎癥消退，間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell,MSC）和其他祖細胞增殖，形成肉芽組織，最終形成軟骨骨痂以穩(wěn)定骨折部位[3-4]。除提供機械穩(wěn)定性外，軟骨還具有為成骨細胞介導骨沉積的支架功能，骨沉積加速骨痂礦化和骨折間隙的閉合[5-6]。然后破骨細胞吸收未成熟的編織骨和軟骨基質(zhì)，并且隨著成熟板層骨的沉積，骨被恢復到其骨折前的結(jié)構(gòu)和完整性[3-4]。而在這骨折的愈合過程中巨噬細胞都扮演著重要角色。

巨噬細胞分為M1、M2 兩大類型，分別發(fā)揮著促炎作用和抗炎作用。近年來，隨著對巨噬細胞研究的不斷深入，尤其是M2 型巨噬細胞及其亞型：M2a、M2b、M2c、M2d，作為治療型巨噬細胞而備受重視，這些亞型巨噬細胞除了具有強大的抗炎作用以外，還分別具有促進細胞遷移增殖、細胞成熟、細胞外基質(zhì)形成和血管形成等重要功能[7-8]。此外，巨噬細胞也能調(diào)節(jié)其他干細胞以及成骨、破骨細胞的功能活性[9]。巨噬細胞的這些功能共同參與骨折的愈合過程。

本文對巨噬細胞的來源、極化及功能進行綜述，重點討論巨噬細胞如何參與骨折的愈合。

1 巨噬細胞的來源、極化及功能

巨噬細胞分為循環(huán)巨噬細胞和組織巨噬細胞，都來源于骨髓造血細胞[10-11]。在骨髓中，前體巨噬細胞在一些細胞因子比如集落刺激因子和粒細胞巨噬細胞集落刺激因子的作用下逐漸發(fā)育成熟，最后釋放入血液循環(huán)。巨噬細胞的極化根據(jù)其功能不同而分類。在Toll 樣受體和干擾素-γ 作用下極化為M1 巨噬細胞，M1 巨噬細胞具有強大的促炎作用，分泌促炎因子IL-3、IL-4、TNF-α 等促進炎癥反應[12-13]。較M1 型巨噬細胞比較，M2 型巨噬細胞因亞型的極化相對較為復雜。IL-4/IL-13 的作用下極化為M2a，在免疫復合物的作用下極化為M2b，在IL-10 或轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor,TGF-β）的作用下極化為M2c，在A2AR 受體的作用下極化為M2d[7-8，14]。極化后，M2a 能促進細胞增殖和遷移、生長因子的產(chǎn)生和凋亡細胞清除；M2b 促進細胞成熟、組織穩(wěn)定、血管生成和細胞外基質(zhì)（extracellular matrix,ECM）合成；M2c促進炎癥消退、組織修復、ECM 合成，并產(chǎn)生生長因子；M2d 促進血管生成和傷口愈合[7-8，14]。巨噬細胞除了作為炎癥細胞外還參與骨髓干細胞的調(diào)節(jié)而加速骨折的愈合[9]。

2 巨噬細胞的招募

巨噬細胞參與骨折的愈合過程必須招募到損傷部位，這是參與骨折愈合的先決條件。招募需要趨化因子或蛋白質(zhì)的幫助。如果缺乏相應的募集蛋白，巨噬細胞就不能完成其修復受損組織的功能。例如，在肌肉損傷中，需要AMP 激活蛋白激酶亞單位α1（AMP-activated protein kinase subunit alpha 1,AMPKa1）來募集巨噬細胞以促進骨骼肌修復再生，并且AMPKa1敲除或突變后阻止巨噬細胞向M2 表型極化，從而使肌肉組織修復難以完成[15]。在骨折中，趨化因子配體2（C-C motif chemokine ligand 2,CCL2）及 其 受 體CCR2（C-C motif chemokine receptor 2,CCR2）是巨噬細胞招募的關(guān)鍵基因[2]。動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，當敲除CCL2/CCR2 基因后或者變異后，骨折處招募到的巨噬細胞較野生型正常組明顯減少[16-17]，并且導致全身骨質(zhì)硬化，骨折無法愈合[16-17]。當骨折時，在CCR2/CCL2 信號有效調(diào)節(jié)單核細胞的運動，CCR2/CCL2 信號精確調(diào)節(jié)下以及其他主要趨化因子如白血病抑制因子、IL-1α、IL-1β和胰腺炎相關(guān)蛋白Ⅲ共同作用下，巨噬細胞從骨髓進入血液，然后從循環(huán)系統(tǒng)進入損傷后的炎癥部位[18-20]。巨噬細胞被招募到損傷處后，巨噬細胞可分泌CCL2、TNF-α、IL-1α 和IL-1β 進一步招募巨噬細胞[20-21]，巨噬細胞招募到骨折部位后為骨折的愈合做好準備。

3 巨噬細胞在骨折愈合過程中的作用

不同于大多數(shù)脊椎動物的其他組織，它們通過形成疤痕組織愈合，而骨折愈合通過再生完成骨折修復，骨折愈合包括血腫炎癥機化期、原始骨痂形成期和骨痂改造重塑期3 個明顯但又互相重疊的階段。在第一階段，炎癥細胞，包括中性粒細胞和巨噬細胞，浸潤和解脫損傷部位。同時，干細胞分化成軟骨細胞和成骨細胞，形成新的軟骨和骨。軟骨隨后通過軟骨內(nèi)骨化過程被骨替代，然后對愈傷組織進行重塑，直到獲得最佳的生物力學性能。而在骨折愈合過程中的每個階段都有巨噬細胞的參與，并扮演著重要角色。

3.1 巨噬細胞為骨折局部清創(chuàng)——血腫炎癥機化期

創(chuàng)傷導致骨折時，局部骨塊及周圍軟組織受到損傷而引起局部炎癥反應表現(xiàn)為血管擴張、血漿滲出、水腫及炎癥細胞浸潤，其中包括嗜中性粒細胞、肥大細胞和巨噬細胞，再加上骨折處滲血而形成骨折周圍血腫。在血腫炎癥機化期，巨噬細胞被招募極化成不同的亞型參與炎癥反應。如上所述，除M1 巨噬細胞激活后，通過上調(diào)清道夫受體CD36，顯示出其強大的吞噬碎片和細菌的能力以及殺菌作用，從而加速異物的清除[22]。M2a、M2b 和M2c 細胞釋放抗炎細胞因子，并增加細胞增殖、遷移和組織重塑，以及生長因子的分泌[23-24]。因此，當巨噬細胞繼續(xù)處于M1 狀態(tài)時，受損組織持續(xù)處于炎癥和慢性創(chuàng)傷狀態(tài)[25]。如前所述，巨噬細胞是促進組織修復的多功能調(diào)節(jié)器[22]。M1 巨噬細胞分泌促炎細胞因子，從而加重炎癥反應和組織壞死，同時也加強了M1 的吞噬功能。相反，M2 巨噬細胞誘導抗炎反應，加速組織修復，有研究將M2 作為治療靶標加速組織的修復[18]。因此在骨折愈合的炎癥階段，M1 和M2 型巨噬細胞的協(xié)調(diào)作用為骨折周圍行清創(chuàng)術(shù)。

3.2 巨噬細胞為骨折愈合提供營養(yǎng)——原始骨痂形成期

損傷立即引起炎癥反應，導致炎癥細胞浸潤，在所有炎癥細胞中，只有巨噬細胞能感覺到缺氧[26]，在這種情況下，它會引起缺氧反應，轉(zhuǎn)錄因子低氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor 1 subunit alpha,HIF-1α）穩(wěn)定并轉(zhuǎn)錄。通過釋放血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、神經(jīng)生長因子等[26]誘導血管生成的誘發(fā)反應。早期研究表明，巨噬細胞通過分泌VEGF-A[26]促進血管生成，維持內(nèi)皮細胞的健康。血管內(nèi)皮細胞是血管新生的基礎，為骨組織修復和再生提供營養(yǎng)。巨噬細胞可以產(chǎn)生骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein,BMP2）[27]，BMP2 在體外已被證明以自動調(diào)節(jié)的方式控制其他BMP 的活性[27]。由于BMP2 在體內(nèi)的早期表達，也提示BMP2 可能啟動其他BMP 的產(chǎn)生，從而刺激骨組織的形成。此外，由于巨噬細胞極化成不同的亞型，可以釋放細胞因子加速血管生成，例如，M2d巨噬細胞分泌IL-10、VEGF，促進血管生成和血管修復[26]。此外，M1 和M2 巨噬細胞促使MSC 向成骨方向分化[9]。而MSC 具有多項分化潛能，在巨噬細胞及其分泌的因子作用下使骨折愈合能力明顯增強[9]。

3.3 巨噬細胞調(diào)節(jié)成骨、破骨活性——骨痂改造塑型期

骨痂改造塑形是原始骨痂中新生骨小梁逐漸增粗，排列逐漸規(guī)則和致密。骨折端的壞死骨經(jīng)破骨和成骨細胞的侵入，完成死骨清除和新骨形成的爬行替代過程。原始骨痂被板層骨所替代，使骨折部位形成堅強的骨性連接，該過程需要1～2年。而骨痂塑型的關(guān)鍵就是維持成骨細胞和破骨細胞的功能活性[28-29]。而巨噬細胞能增強成骨細胞和破骨細胞的活性和功能，對骨痂的塑型發(fā)揮著重要作用。M1 型巨噬細胞可增強破骨細胞的形成潛力，從而增強破骨細胞的作用[28-29]。當骨壞死時，TNF-α 高表達而使周圍M1 巨噬細胞大量增多[28-29]。隨著骨壞死的進一步進展，骨壞死區(qū)的TNF-α 表達降低，此時骨壞死區(qū)聚集大量的M2 型巨噬細胞，抑制壞死物質(zhì)引起的炎癥反應而為骨壞死后的再生創(chuàng)造良好的微環(huán)境[29]。

成骨細胞的增殖和分化受多種細胞因子的調(diào)節(jié)，如生長因子、TGF-β、骨生成蛋白等[30-31]，而巨噬細胞能分泌這些因子來調(diào)節(jié)成骨細胞的增殖和分化。因此，巨噬細胞能介導原始骨痂整形。

4 巨噬細胞在骨折不愈合中的潛在應用

近年來，隨著骨折不愈合患者的不斷增多，給臨床的治療帶來了挑戰(zhàn)。臨床中形成骨折不愈合的原因是多方面的，且較為復雜，有患者本身因素，也有疾病因素，還有技術(shù)因素，諸多因素中，骨折不愈合患者的根本原因是骨折經(jīng)相應的治療后局部的血供不足，使得骨折局部缺乏營養(yǎng)而導致骨折延遲愈合或者不愈合[9]。目前對于骨折不愈合的治療有多種方法，包括自體骨移植、更換固定方式、自體骨髓移植、中醫(yī)中藥等。而手術(shù)是首先方法，其目的就是使得骨折不愈合處周圍的硬化骨組織重新獲得血液供應，重啟正常的骨愈合過程[32]。

除上述提到的治療方法以外，骨組織工程也成為研究治療骨折不愈合的熱點。目前，該研究主要基于骨髓MSC 的骨組織工程研究治療骨折不愈合[33]。因為骨髓MSC 具有分化為骨、軟骨和血管等多重分化功能，并且易于獲取以及體外擴增，因此在基于骨髓MSC 的骨組織工程為骨缺損或骨折不愈合的治療帶來新的希望。相比之下，迄今為止很少有研究利用巨噬細胞或靶向巨噬細胞-MSC 共同作用來增強骨再生治療骨折不愈合。然而，隨著巨噬細胞在骨再生中的關(guān)鍵作用日益被重視，以增強骨折愈合為目標的治療方案也開始出現(xiàn)。有文獻指出，通過靶向巨噬細胞-MSC 的共同作用，明顯地增強骨再生能力，提高骨折不愈合的治療效果。增加骨折部位巨噬細胞的數(shù)量和調(diào)節(jié)局部巨噬細胞極化以增強骨再生[9]。在臨床上，自體骨髓通常用于治療骨折不愈合和骨壞死[34]。盡管這些策略的主要目標是將骨髓成骨細胞輸送到損傷部位，但這些治療也不可避免地含有大量的單核細胞/巨噬細胞譜系和其他細胞，實際上可以認為它是利用巨噬細胞在骨折愈合中的強大作用來治療骨折不愈合[9]。后來有研究表明，將IL-4 和IL-13 浸在膠原蛋白支架處，可使骨截骨局部的骨痂生成及骨再生能力明顯增強[35]。

5 總結(jié)和展望

巨噬細胞是炎癥反應中的關(guān)鍵性炎癥細胞之一。許多研究表明巨噬細胞被招募到損傷部位并參與骨折的愈合過程。有研究指出，在骨折愈合過程中巨噬細胞具有清理組織碎片，抗炎，促進血管生長以及調(diào)節(jié)成骨細胞和破骨細胞的功能活性，不僅在骨折愈合中起重要作用，而且可以作為治療靶點，在骨折不愈合的治療中具有潛在的應用價值。巨噬細胞作為炎癥細胞具有雙重性質(zhì)，一方面使炎癥和組織壞死加劇，另一方面抗炎保護組織和促進修復。在骨折愈合的炎癥反應階段，M1 巨噬細胞分泌促炎因子，從而加重炎癥反應和組織壞死，同時也加強M1 的吞噬功能。相反，M2 巨噬細胞誘導抗炎反應，抑制炎癥反應。然而，在骨折愈合的血腫炎癥階段，M1 和M2 巨噬細胞的協(xié)調(diào)作用才能為骨折清創(chuàng)，隨后分泌相關(guān)細胞因子為骨痂形成提供營養(yǎng)，最終介導骨痂的塑形。

雖然巨噬細胞在骨折愈合的過程中扮演著重要角色，但是在骨折不愈合的治療過程中利用其作為治療靶點仍然不被重視。而骨折不愈合治療的根本目標就是改善局部的血供，而巨噬細胞是唯一能感知缺氧的炎癥細胞，并釋放血管生成因子促進血管生成，改善局部血供。然而，目前利用巨噬細胞治療骨折不愈合的研究甚少，在未來的研究中如果實現(xiàn)巨噬細胞作為靶向細胞來治療骨折不愈合，或許將極大地促進骨折的愈合，改善愈后。尤其是在骨組織中，利用巨噬細胞作為種子細胞，輸送到不愈合骨折處；或者是支架材料上復合上巨噬細胞的趨化因子和/或極化因子，提高局部巨噬細胞的含量，從而加速骨折愈合。這些都有待于進一步研究。當然對血供較差的骨折部位，在局部注入巨噬細胞積極預防骨折不愈合的發(fā)生也不失為一個良好的選擇。但是對巨噬細胞輸入到血供較差的部位時細胞量、細胞亞型都需要進一步研究，確定多少細胞量、哪個亞型能更好地促進骨折愈合。