才 華，王 碩，董 理，孫 娜，宋婷婷，楊圣秋，許慧慧

（東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150030）

紫花苜蓿（Medicago sativa）是多年生豆科草本植物，是世界種植面積最廣的牧草之一。以紫花苜蓿為原料的動物飼料營養(yǎng)全面，適口性好，是重要的蛋白飼料。紫花苜蓿在飼料加工、保持土壤水分，提高土地肥力、生態(tài)植被修復等方面具有重要作用[1]。

我國土地鹽堿化問題嚴重。當土壤表層離子含量維持在一定范圍時，促進植物生長，當離子（Na+、K+、Mg2+、）大量積累則造成土地鹽堿化[2]。若植物長期生存在高鹽土壤中，其體內(nèi)積累大量陰陽離子，遭受鹽堿脅迫損害。鹽堿脅迫改變植株滲透勢造成生理性缺水，植物體內(nèi)離子平衡失調(diào)，生理生化指標異常，正常生長受阻，可能導致植物死亡[3]。

根瘤菌是土壤中的革蘭氏陰性菌，主要與豆科植物共生，將空氣中的氮氣轉(zhuǎn)化為植物可直接利用的氮素。豆科植物-根瘤菌共生固氮在自然界生物固氮中尤為重要，生物固氮對促進植株生長，提高作物產(chǎn)量、抗性具有重要作用[4-5]。豆科植物-根瘤菌共生可改善干旱和鹽脅迫狀況下苜蓿生長狀況，提高紫花苜蓿產(chǎn)量，主要表現(xiàn)在抗氧化能力增強，尤其是根部滲透調(diào)節(jié)能力增強，通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外K+、Na+、H+、Ca2+流動，保持細胞內(nèi)離子環(huán)境平衡，維持滲透壓[6]。接種根瘤菌的紫花苜蓿耐旱性和耐鹽性增強，根瘤在抵御干旱和鹽脅迫上有促進作用。劉倩等研究共生根瘤菌對混合鹽堿脅迫下紫花苜?？寡趸蜐B透調(diào)節(jié)能力的影響發(fā)現(xiàn)，接種根瘤菌可有效提高紫花苜?？寡趸蜐B透調(diào)節(jié)能力[7]。

在這種共生關(guān)系中，植物為根瘤菌提供能量和碳骨架等同化物，根瘤菌通過固氮酶完成固氮，為植物供應氮源。同化物運輸至根瘤通過韌皮部將蔗糖轉(zhuǎn)換成二羧酸，主要為蘋果酸鹽和琥珀酸鹽形式[8]。在共生過程中，代謝中間產(chǎn)物如可溶性多糖、有機酸和氨基酸類等物質(zhì)對于調(diào)節(jié)細胞滲透壓、pH、活性氧清除等具有積極作用。Aranjuelo等研究指出，固氮植物在其他逆境條件下，在不同過程中限制根瘤功能、如碳水化合物利用、含氮化合物累積、O2滲透率和活性氧物質(zhì)（Reactiveoxygen species，ROS）累積等[9]。紫花苜蓿固氮作用和根瘤菌抗逆性研究較為深入，而根瘤共生對紫花苜蓿堿脅迫的響應機制尚不明確。宋婷婷等研究表明，根瘤共生提高紫花苜蓿根系有機酸積累，減緩堿性土壤對根的傷害[10]。另外，根瘤形成過程中抗氧化能力增強對提高紫花苜蓿耐堿有積極作用。

本研究利用耐堿根瘤菌CCBAU 81024接種紫花苜蓿，測定堿脅迫下接種根瘤菌的紫花苜蓿相對葉綠素含量、根及葉中丙二醛含量、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、抗氧化酶酶活等生理生化指標，探索共生根瘤菌對紫花苜蓿耐堿性的影響，為后期開發(fā)根瘤菌制劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

植物為紫花苜蓿（Medicao sativa L.）龍牧806，購自黑龍江省畜牧研究所。菌種為苜蓿中華根瘤菌（CCBAU 81024）（Rmizobium meliloti strain Dormal），購自中國農(nóng)業(yè)大學CCBAU根瘤菌保存庫。培養(yǎng)基質(zhì)選取河沙（流水沖洗15 min后蒸餾水沖洗1次，121℃滅菌2 h，保證基質(zhì)中無其他微生物菌群）。

試驗儀器：人工氣候培養(yǎng)室，小型高速離心機，多量程移液槍，大型低溫高速離心機，葉綠素測定儀，1 mL石英/玻璃比色皿，電導率測定儀，恒溫水浴鍋，天平，葉綠素儀，電導率儀，烘干箱，水平搖床，紫外/可見分光光度計，研磨機等。

試驗時間為2017年10月～2018年3月。

1.2 方法

1.2.1 根瘤菌接種、堿處理及取材

取400粒紫花苜蓿龍牧806種子，75%乙醇種皮表面消毒，10%次氯酸鈉滅菌5 min后，滅菌水充分沖洗種皮表面后移入鋪有濕潤濾紙的平皿中萌發(fā)。種子在培養(yǎng)箱中萌發(fā)（光照16 h，25℃），待種子長出子葉后沙土移栽。接種根瘤菌處理的植株在幼苗移栽前用編號為CCBAU 81024根瘤菌液浸泡后移栽于沙土中。1/5倍Hoagland營養(yǎng)液澆灌4周，第5周時接菌植株澆灌無氮營養(yǎng)液，激活根瘤菌，每月定期接種1次根瘤菌液。未接菌植株持續(xù)澆灌1/5Hoagland營養(yǎng)液。

16周后，用濃度100 mmol·L-1NaHCO3（pH 8.5）溶液堿脅迫處理，分成2組，即堿處理組和對照組。每組分為NI組和RI組，各5株，每5株置于托盤中，重復3次。100 mmol·L-1NaHCO3脅迫處理。堿處理組，每個托盤加堿脅迫液1 L，每日補加水100 mL，pH 8.5。對照組則加水1 L，每日補加水100 mL。

分別在未處理、處理5、8 d時，通過無損傷方式測定葉綠素含量。于10：00～14：00測定電導率和相對含水量。隨機選取苜蓿根和葉片，液氮保存，測定生理生化指標。

1.2.2 株高、根長、葉綠素及相對含水量測定

葉綠素測定：用葉綠素儀（型號TYS-B）分別測定植株上、中、下部共6個葉片SPAD值，取平均值，每組各測定30株。

株高、根長測定：直尺測量兩組植株根長、株高。

相對含水量測定：采取“鮮重法”測定含水量。采集新鮮葉片測鮮重（Wf），將葉片烘干至恒重后獲得干重（Wd）。

葉片相對含水量（LRWC，%）=（Wf-Wd）/（Wt-Wd）×100%。

式中，Wf-鮮重；Wd-干重；Wt-飽和鮮重。

1.2.3 相對電導率測定

采用抽真空方法測定葉片電導率[11]。將葉片用去離子水洗凈后抽真空測其電導率為S1，煮沸10 min后再次測得電導率為S2，去離子水電導率為S0。

相對電導率（L）=（S1-S0）/（S2-S0）。

式中，S1-初始電導值；S2-終電導值；S0-空白電導值。

1.2.4 生理指標測定

采用可見分光光度法測定丙二醛（MDA）、脯氨酸（Pro）、可溶性糖含量，試劑盒購自蘇州科銘生物有限公司，按照試劑盒說明書操作。

1.2.5 抗氧化酶活性測定

SOD、POD測定采用可見分光光度法。CAT測定采用紫外分光光度法。所用試劑盒由蘇州科銘生物有限公司提供。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計分析試驗數(shù)據(jù)標準差、方差并作T-檢驗處理，分析接種根瘤菌植株生理生化指標與未接菌植株差異，P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿脅迫下NI與RI紫花苜蓿葉綠素含量和相對含水量差異

由圖1可知，未經(jīng)堿脅迫處理時，RI葉綠素含量高于NI組，且差異顯著（P＜0.05），是NI組的1.219倍。當植株遭受堿脅迫時，隨脅迫時間增加NI組葉綠素含量極顯著下降，而RI組葉綠素含量下降不顯著。堿脅迫處理8 d時，NI葉綠素含量顯著低于RI（P＜0.05）。對比分析可知，接種根瘤菌紫花苜蓿受堿脅迫傷害顯著低于未接菌紫花苜蓿。

由圖2可知，正常條件下，NI與RI相對含水量差異顯著（P＜0.05），當堿脅迫處理8 d時，NI組下降明顯，RI組雖有所下降，但含水量顯著高于NI，具有顯著性差異（P＜0.05）。

NI、RI兩組未經(jīng)堿處理時株高和根長見圖3，各組無顯著差異，但RI接菌組根長與NI未接菌組相比顯著優(yōu)于NI，是NI組1.09倍（P＜0.05），表明接種根瘤菌可提高紫花苜蓿生長量。

圖1 堿脅迫處理不同時間點紫花苜蓿葉綠素含量Fig.1 Chlorophyll content of alfalfa under different timepointsof alkalitreatment

圖2 堿脅迫處理不同時間點紫花苜蓿葉片相對含水量Fig.2 Relativewater content of alfalfa leaves at different time points under alkalistress

圖3 未經(jīng)堿脅迫處理時植株株高和根長Fig.3 Plant height and root length without alkalitreatment

2.2 堿脅迫下NI與RI植株細胞膜損傷程度的差異

由圖4可知，正常條件下，兩組植株葉片相對電導率基本相同，當堿脅迫8 d時，NI組相對電導率是RI的1.7倍，存在顯著差異（P＜0.05）。NI組紫花苜蓿相對電導率堿脅迫8 d后，較未處理顯著提高。由此表明，在遭受堿脅迫時，RI組細胞膜損害較NI組小。

圖4 堿脅迫處理不同時間點紫花苜蓿葉片相對電導率Fig.4 Relative conductivity of alfalfa leavesunder different timepoints of alkalitreatment

由圖5可知，正常條件下，NI和RI兩組紫花苜蓿葉片MDA含量存在顯著差異（P＜0.05），NI的MDA含量是RI的1.3倍。堿脅迫處理后，NI組MDA含量顯著上升，而RI組MDA含量變化不顯著。根部MDA含量變化整體趨勢與葉相同，堿脅迫8 d時，NI與RI相比差異顯著，是RI 3.77倍。根和葉中MDA含量表明，接種根瘤菌可有效降低MDA含量，緩解堿脅迫對細胞膜傷害。

圖5 堿脅迫處理不同時間點紫花苜蓿葉和根中MDA含量Fig.5 MDA contentsof alfalfa leavesand root under different timepointsof alkalitreatment

2.3 NI與RI組堿脅迫抗氧化酶活性的差異

由圖6可知，正常生長條件下根中SOD酶活無差異，而葉中NI和RI差異顯著（P＜0.05），RI葉中SOD酶活是NI1.87倍。堿脅迫處理后，根中SOD酶活下降，而葉中SOD酶活變化較小。堿脅迫處理 8 d時，RI組根和葉中SOD酶活均顯著高于NI組（P＜0.05）。

由圖7可知，POD與SOD均為抗氧化物酶，活性變化相似，正常條件下，根和葉中RI組POD酶活均顯著高于NI組。堿脅迫處理8 d后，NI組POD酶活顯著下降。堿脅迫處理8 d時，RI組POD酶活均顯著高于NI組，在葉和根中分別是NI組的1.96和1.38倍。

由圖8可知，CAT無規(guī)律變化，正常條件下，葉中RI組和NI組無顯著差異，根中差異顯著，RI組活性是NI的1.55倍。堿脅迫處理8 d后，在根和葉中，均表現(xiàn)出RI組CAT酶活顯著高于NI組。結(jié)合SOD和POD結(jié)果可知，接種根瘤菌可提高SOD和POD酶活，增強堿脅迫后葉片CAT活性，提高紫花苜?？寡趸芰?，增強耐堿性。

圖6 堿脅迫處理不同時間點紫花苜蓿葉和根中SOD活性Fig.6 SODactivity of alfalfa leavesand root under different timepointsof alkalitreatment under alkalinestress

圖7 堿脅迫處理不同時間點紫花苜蓿葉和根中POD活性Fig.7 POD activity of alfalfa leaves and root under different time points of alkalitreatment

圖8 堿脅迫處理不同時間點紫花苜蓿葉和根中CAT活性Fig.8 CAT activities of alfalfa leaves and root under different time points of alkalitreatment

2.4 堿脅迫下NI與RI滲透調(diào)節(jié)能力的差異

由圖9可知，未經(jīng)堿脅迫處理，根中NI和RI組中可溶性糖含量差異顯著。堿脅迫處理8 d后，RI組葉中可溶性糖含量變化顯著。堿脅迫處理8 d時，根和葉中，NI與RI組可溶性糖含量差異顯著（P＜0.05）。由圖10可知，未經(jīng)堿脅迫處理時，根和葉中均表現(xiàn)為RI組脯氨酸含量顯著高于NI組（P＜0.05）。隨堿脅迫時間延長，脯氨酸含量均上升。堿脅迫處理8 d時，NI和RI組中，根和葉均積累大量脯氨酸，兩組間無顯著差異。

圖9 堿脅迫處理不同時間點紫花苜蓿根和葉中可溶性糖含量Fig.9 Soluble sugar contents of alfalfa leaves and root under different time points of alkalitreatment

圖10 堿脅迫處理不同時間點紫花苜蓿根和葉中脯氨酸含量Fig.10 Proline contents of alfalfa leaves and root under different time points of alkalitreatment

3 討 論

作為非生物脅迫，堿脅迫比鹽脅迫對植物生長影響更嚴重，主要表現(xiàn)在抑制光合效率[12]，影響植株生長和抗逆性[13]。葉綠素作為參與植物光合作用重要物質(zhì)，將環(huán)境中CO2經(jīng)可見光轉(zhuǎn)化為能量和有機物，供自身生長所需，通過光合作用，不僅為豆科植物提供根瘤固氮所需能量，還為根瘤固氮提供代謝用碳架。當植株遭受堿脅迫時，其葉片細胞結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，光合受阻，光合速率下降，其含量也可衡量植株生長狀態(tài)[14]。Yang等也證明隨鹽度和pH增大，紫花苜蓿葉片凈光合速率、氣孔導度和胞間CO2濃度下降[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，在正常生長條件下，接種耐堿根瘤菌紫花苜蓿（RI）葉綠素含量顯著高于未接種組（NI），經(jīng)堿脅迫處理后，RI組葉綠素含量變化不顯著，而NI組葉綠素含量則極顯著下降。由此表明，接種耐堿根瘤菌促進苜蓿光合作用，植株生長健壯，減緩逆境脅迫傷害。RI組相對含水量顯著高于NI組，作為反映植株抗性及代謝速率的重要生理指標[16]，表明根瘤菌可提高紫花苜蓿代謝速率。

游離脯氨酸是植株應對鹽堿脅迫的一種重要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，當植株遭受鹽堿脅迫時脯氨酸大量積累[17]，利于緩解堿脅迫的滲透傷害，也是其遭受逆境脅迫的信號。本研究發(fā)現(xiàn)，正常條件下，根和葉均表現(xiàn)為RI組脯氨酸含量顯著高于NI組（P＜0.05）。但堿脅迫處理后，根和葉中脯氨酸含量均上升，NI組與RI組無顯著差異。課題組前期分析根瘤菌接種苜蓿的代謝組發(fā)現(xiàn)，接種根瘤菌后，紫花苜蓿根中氨基酸代謝物質(zhì)增加，TCA、糖代謝中代謝中間產(chǎn)物增加，其中包括氨基酸、有機酸、海藻糖及各種糖類等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[10]。堿脅迫后，接種根瘤菌苜蓿相對于未接種根瘤菌苜蓿，除脯氨酸外，還有其他滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)發(fā)揮作用，如有機酸和海藻糖等。由此可知，根和葉堿脅迫后，NI和RI組脯氨酸無顯著差異?？扇苄蕴遣粌H是植物生長重要營養(yǎng)物質(zhì)，也是響應逆境脅迫的信號分子，在滲透調(diào)節(jié)中起重要作用[18]。由可溶性糖含量變化可知，接種根瘤菌增強紫花苜蓿滲透調(diào)節(jié)能力。本研究中可溶性糖含量在堿脅迫初期差異顯著，隨堿脅迫時間增加，葉可溶性糖含量不斷提高，且RI顯著高于NI組，表明RI對于堿脅迫比NI適應性更好，隨堿脅迫時間延長，可溶性糖迅速積累，有效滲透調(diào)節(jié)。

相對電導率反映植株在逆境條件下細胞膜受破壞程度[19]。當植株受堿脅迫處理后，除植株表型發(fā)生改變外，植株細胞膜結(jié)構(gòu)和功能受損，引起質(zhì)膜透性增加，機體內(nèi)部代謝途徑也發(fā)生相應改變，主要表現(xiàn)在細胞內(nèi)離子平衡失調(diào)、生理代謝受阻、細胞內(nèi)溶物外滲[20]。通過檢測發(fā)現(xiàn)，葉片相對電導率隨堿脅迫時間延長而增加。NI、RI兩組電導率在處理8 d時差異顯著，RI電導率顯著低于NI未接種組，說明在堿脅迫下其細胞膜受損程度較小，接種根瘤菌顯著提高苜蓿細胞膜穩(wěn)定性。在非生物脅迫下，活性氧大量累積從而對植株造成毒害作用，若不及時清除會破壞細胞完整性，MDA大量累積[21]。測定MDA含量，可間接評價膜系統(tǒng)受損害程度及植株抗逆性[22]。本試驗中，堿脅迫處理前兩組MDA含量存在顯著差異，隨堿脅迫時間延長MDA含量上升，但RI組MDA含量顯著低于NI。Wang等研究表明，耐鹽性較強牧草較鹽敏感型牧草MDA含量增長率低[23]。由此表明，接種根瘤菌可緩解堿脅迫對紫花苜蓿細胞膜損傷。

在非生物脅迫下，植株體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧（ROS），而ROS水平過高則會導致植株死亡。SOD、POD、CAT是植物體內(nèi)主要抗氧化物酶，通過清除體內(nèi)活性氧保護酶系統(tǒng)，其活性提高可增強植物清除活性氧自由基能力[24-25]。在鹽堿脅迫下，抗氧化酶POD、SOD、CAT活性提高可恢復氧化平衡[26-27]。本研究發(fā)現(xiàn)，RI組紫花苜蓿POD、SOD、CAT活性在堿處理前后均顯著高于NI組。表明接種根瘤菌可有效提高植株抗氧化能力。

Noor等研究表明，共生根瘤菌可提高紫花苜蓿及豆科植物抗旱和耐鹽能力，提高紫花苜蓿產(chǎn)量[28]。研究發(fā)現(xiàn)，正常情況下，接種根瘤菌降低MDA含量和電導率，提高可溶性糖和脯氨酸含量，增加SOD、POD、CAT抗氧化酶酶活，可緩解堿脅迫對紫花苜蓿細胞膜損傷，增強滲透調(diào)節(jié)能力和抗氧化能力，使苜蓿具有耐受堿脅迫能力。另外，本研究使用CCBAU 81024耐堿根瘤菌可耐受pH 10.5，對低堿條件不敏感，在堿脅迫條件下依然保持較高的根瘤固氮促生作用，可用于中度及重度鹽堿地苜蓿生產(chǎn)。