屈淑平，綦 聰，王云莉，姜 宇，徐文龍，崔崇士

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，哈爾濱 150030）

南瓜是人類最早栽培蔬菜之一，屬于葫蘆科（Cucurbitaceae）南瓜屬（Cucurbita），為一年生蔓生草本植物，其營(yíng)養(yǎng)豐富，藥用和食用價(jià)值較高。南瓜種植面積逐年增大，但多種病害嚴(yán)重影響南瓜植株生長(zhǎng)，其中白粉病是主要病害之一。隨著白粉病病情加重，植株無(wú)法正常通過(guò)光合作用提供營(yíng)養(yǎng)，導(dǎo)致籽粒不飽滿、果實(shí)減產(chǎn)、品質(zhì)下降等[1]。

目前，引起瓜類白粉病病原菌主要有3個(gè)屬：白粉菌屬（Erysiphe）、內(nèi)絲白粉菌屬（Leveillula）及單囊殼屬（Podosphaera），6個(gè)種分別是E.cichoracearum、 E.polygoni、 E.polyphage、 E.communis、L.taurica和P.xanthii。P.xanthii報(bào)道最多，其次為E.cichoracearum[2]。P.xanthii已發(fā)現(xiàn)有11個(gè)生理小種，分別是生理小種0、1、2U.S、2France、3、4、5、N1、N2、N3和N4。

張怡、肖仲久等利用形態(tài)觀察及ITSrDNA序列分析方法，分別鑒定河南、貴州省4個(gè)城市白粉菌，瓜類白粉病病原菌均為Podosphaera xanthii[曾 用 名 Sphaerotheca fuliginea（Schlecht.Ex Fr.）Pollacci][3-4]。李蘋(píng)芳、蘇瑞等利用當(dāng)?shù)匕追鄄【b定13個(gè)甜瓜通用鑒定寄主，確定江浙滬、新疆地區(qū)生理小種分別為race1、race5[5-6]。劉東順等利用同樣方法鑒定確定甘肅地區(qū)白粉病生理小種為2Frace和N2[7]。黑龍江地區(qū)近年南瓜生產(chǎn)中白粉病病害嚴(yán)重，劉秀波等研究黑龍江地區(qū)侵染瓜類白粉菌種類及生理小種，確定其病原菌均為Podosphaera xanthii，而2009年優(yōu)勢(shì)生理小種由race1變?yōu)?Frace[8-9]。

為進(jìn)一步調(diào)查黑龍江地區(qū)侵染南瓜白粉病病原菌種類及生理小種變化，本試驗(yàn)觀察黑龍江省白粉病病原菌形態(tài)結(jié)構(gòu)、分析白粉病病原菌ITS序列，開(kāi)展13個(gè)白粉病甜瓜通用鑒別寄主侵染試驗(yàn)，以確定病原菌種類及其生理小種，隨后利用鑒定生理小種白粉菌侵染64份南瓜種質(zhì)資源，通過(guò)植株抗白粉病表現(xiàn)篩選高抗白粉病種質(zhì)資源，為南瓜白粉病抗病基因定位及培育抗白粉病新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

白粉病寄主選用易感病南瓜自交系“JIN-234”及64份種質(zhì)資源鑒定材料，均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院南瓜育種研究室提供。南瓜自交系“JIN-234”2017年春季種植于哈爾濱市香坊區(qū)向陽(yáng)鎮(zhèn)東北農(nóng)業(yè)大學(xué)南瓜實(shí)驗(yàn)基地大棚，用于病原菌分離與鑒定，64份種質(zhì)資源鑒定材料2018年春季隔離種植于向陽(yáng)鎮(zhèn)南瓜實(shí)驗(yàn)基地大棚，用于抗性鑒定。

國(guó)際通用鑒別寄主：Iran H、Top mark、Vedrantais、PMR45、PMR5、MR29、Edisto47、PI414723、MR1、PI 124111、PI124112、PMR6、Nantais 和Oblong，由上海交通大學(xué)黃瓜育種實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。甜瓜鑒別寄主于2018年春季種植于向陽(yáng)鎮(zhèn)南瓜實(shí)驗(yàn)基地大棚。

1.1.2 白粉病病原菌材料

白粉病病原菌取自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)南瓜實(shí)驗(yàn)基地自然發(fā)病南瓜植株葉片。

1.2 方法

1.2.1 白粉病病原菌分離純化

2017年7月中旬收集自然發(fā)病南瓜葉片白粉菌單菌落于吐溫20中，制成2.5×105～5.0×105個(gè)·mL-1孢子懸浮液，噴施于南瓜健康幼苗植株葉片上，后置于25～30℃、濕度80%以上環(huán)境中，經(jīng)5次分離純化后利用易感病南瓜植株擴(kuò)繁，活體保存，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 白粉病病原菌形態(tài)觀察

參照王佩玲等方法[10]，利用挑取法制作臨時(shí)玻片觀察分生孢子，水合氯醛組織透明法制作臨時(shí)玻片觀察分生孢子梗。參照馬鴻艷等方法[9]，利用KOH溶液觀察纖維狀體，取白粉菌無(wú)性世代于載玻片上，滴加1滴3%KOH溶液，蓋上蓋玻片，10×40倍光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.3 致病性檢測(cè)

按照科赫法則利用噴霧法作白粉菌回接試驗(yàn)，檢驗(yàn)白粉病病原菌致病性。取分離純化后南瓜葉片白粉菌單菌落于吐溫20中，制成2.5×105～5.0×105個(gè)·mL-1孢子懸浮液。種植20株南瓜幼苗。當(dāng)植株長(zhǎng)至兩片真葉時(shí)，取10株幼苗噴施孢子懸浮液于南瓜葉片上，10株幼苗噴施無(wú)菌水滴加吐溫20溶液作對(duì)照。將處理后植株幼苗置于25～30℃、濕度80%以上環(huán)境中，觀察病原菌發(fā)病情況，確定其致病性。

1.2.4 白粉病病原菌分子鑒定

美洲南瓜白粉病病原菌總DNA提?。翰捎酶牧糃TAB法提取白粉菌總DNA[11]。

ITS序列PCR擴(kuò)增引物與程序：利用真菌核糖體ITS區(qū)段通用引物ITS1、ITS4作PCR，序列為：ITS1（5'TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3'）和 ITS4（5'TCCTCCGCTTATTGATATGC 3'）。 PCR 體系 為：10×Buffer 2μL，dNTP 2μL，DNA模板1.2μL，上下引物各0.8μL，Taq酶0.2μL，ddH2O 13μL。PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性94℃5 min；變性94℃30 s，退火50℃ 30 s，延伸72℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；再延伸72℃，10 min。

凝膠電泳檢測(cè)：取3μL PCR產(chǎn)物，EB染色，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，通過(guò)瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)觀察成像結(jié)果。

PCR產(chǎn)物回收與載體連接：參照膠回收試劑盒（購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司）說(shuō)明操作，利用膠回收產(chǎn)物與T3載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)藍(lán)白斑篩選方法挑取陽(yáng)性單克隆，菌液PCR檢測(cè)陽(yáng)性菌落，送至北京華大基因科技有限公司正反雙向測(cè)序。

序列分析：將南瓜白粉病病原菌ITS序列利用BLAST在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中搜尋比對(duì)，使用DNAMAN將軟件作序列比對(duì)分析。Mega 5.0鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.5 白粉病病原菌生理小種鑒定

采用國(guó)際通用13個(gè)甜瓜白粉病生理小種鑒別寄主。通過(guò)寄主分析不同白粉菌生理小種抗感反應(yīng)以區(qū)別本試驗(yàn)中感染南瓜白粉病病原菌生理小種，寄主對(duì)不同生理小種抗感反應(yīng)表現(xiàn)見(jiàn)表1，每一品系鑒別寄主種植10株。植株長(zhǎng)至4葉1心時(shí)取分離純化后南瓜葉片白粉菌于吐溫20中，制成濃度為2.5×105～5.0×105個(gè)·mL-1懸浮液，噴霧法噴濕鑒別寄主葉片，溫度25～30℃，濕度80%以上，接菌10 d后觀察鑒別寄主發(fā)病情況。鑒定標(biāo)準(zhǔn)、病情指數(shù)（DI）計(jì)算參照文獻(xiàn)[12]（見(jiàn)表1、2）。

病情指數(shù)（DI）計(jì)算如下:

DI=Σ（sini）·（5N）-1·100

式中，si為發(fā)病等級(jí)，ni為相應(yīng)發(fā)病等級(jí)植株數(shù)目，N為調(diào)查總株數(shù)觀測(cè)量。0＜DI≤40時(shí)為抗病，記為R；40＜DI＜60時(shí)為中間型，記為H；DI≥60為感病，記為S。根據(jù)甜瓜鑒別寄主抗、感反應(yīng)鑒定白粉病菌生理小種。

1.2.6 病原菌鑒定在種質(zhì)資源開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用

利用分離純化后白粉菌對(duì)64份美洲南瓜種質(zhì)資源在成株期作抗性鑒定，條件與生理小種鑒定接菌試驗(yàn)一致，接菌20 d后鑒定64份種質(zhì)資源抗感病情況。鑒定標(biāo)準(zhǔn)參照李錫香[12]等研究（見(jiàn)表2）。病情指數(shù)（DI）計(jì)算同1.2.5，根據(jù)病情指數(shù)計(jì)算結(jié)果判斷種質(zhì)資源抗性表現(xiàn)。

表1 甜瓜白粉病生理小種鑒別寄主及其抗感反應(yīng)Table1 Identification of host racesof melon powdery mildew and its anti-influence

表2 植株抗感白粉病情況鑒定標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Identification criteria for resistance to powdery mildew in plants

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌形態(tài)特征

取分離純化后白粉菌在10×40倍顯微鏡下觀察分生孢子、纖維狀體和分生孢子梗形態(tài)（見(jiàn)圖1）。分生孢子呈廣橢圓形，長(zhǎng)（28.61±3.51）μm，寬（19.14±2.15）μm。病原菌分生孢子內(nèi)均含明顯纖維狀體，每個(gè)分生孢子內(nèi)含纖維狀體1～10個(gè)，平均5個(gè)（見(jiàn)圖1a）。分生孢子梗由孢子串生形成，長(zhǎng)（98.54±13.65）μm，寬（13.94±1.78）μm（見(jiàn)圖1b）。通過(guò)以上形態(tài)特征觀察初步判斷，此白粉菌為單囊殼白粉菌（Podosphaera xanthii）。

2.2 病原菌致病性

將純化后白粉病病原菌懸浮液噴霧接種“JIN-234”南瓜幼苗葉片，6 d后葉片表面出現(xiàn)圓形白色粉狀斑點(diǎn)，10 d后植株葉片白粉斑點(diǎn)逐漸聚集成片（見(jiàn)圖2），發(fā)病狀態(tài)與自然發(fā)病情況相似。再次鏡檢發(fā)病植株白粉菌，其分生孢子等形態(tài)特征與自然發(fā)病植株表現(xiàn)一致，表明其仍為單囊殼白粉菌（Podosphaera xanthii）。

圖1 病原菌形態(tài)觀察Fig.1 Morphological observation of pathogens

圖2 南瓜幼苗接菌10 d后植株感病情況Fig.2 Situation of susceptible plants after 10 d of pumpkin seedlings inoculation

2.3 病原菌分子鑒定

利用改良CTAB法提取南瓜白粉菌總DNA，利用通用引物ITS1、ITS4擴(kuò)增得到長(zhǎng)度約564 bp DNA片段，電泳結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 白粉菌DNA擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 DNA amplification results of powdery mildew

該序列GenBank授權(quán)登錄號(hào)為MH084745。NCBI上BLAST分析發(fā)現(xiàn)，南瓜白粉病病原菌ITS核苷酸編碼序列中1～29位為18SrDNA部分序列，30～207位為ITS1區(qū)段序列，208～361位為5.8SrDNA全序列，362～505位為ITS2區(qū)段序列，506～564位為28SrDNA部分序列。運(yùn)用DNAMAN將序列與侵染瓜類白粉菌其他序列比對(duì)，結(jié)果見(jiàn)圖4。結(jié)果表明南瓜白粉菌與Podosphaera xanthii序列一致性高達(dá)99%，同源性較高。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果可見(jiàn)圖5，南瓜白粉菌ITS序列相比于E.cichoracearum、E.polygoni、L.taurica序列，其與苦瓜單囊殼（Podosphaera xanthii PM2）、甜瓜單囊殼（Podosphaera xanthii PMJS1）、美女櫻單囊殼（Podosphaera xanthii MUMH808）、棉葉膏桐單囊殼（Podosphaera xanthii JG1）、紅雀珊瑚單囊殼（Podosphaera xanthii ET1）等同緣關(guān)系最近。通過(guò)分子鑒定進(jìn)一步證明侵染南瓜白粉病病原菌為單囊殼白粉菌（Podosphaera xanthii）。

圖4 同源序列比對(duì)（紅線區(qū)域?yàn)楸Ｊ貐^(qū)域）Fig.4 Comparison of homologoussequences（The red line area is a conservativearea）

圖5 根據(jù)ITS序列構(gòu)建南瓜白粉菌系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Phytophaga phylogenetic tree constructed based on the ITSsequence

2.4 病原菌生理小種

采用孢子懸浮液噴霧法，將純化的南瓜白粉病菌接種于13個(gè)國(guó)際通用鑒別寄主葉片上，通過(guò)寄主對(duì)不同白粉菌生理小種產(chǎn)生的抗感反應(yīng)區(qū)分本試驗(yàn)中感染南瓜的白粉病病原菌生理小種，鑒定結(jié)果見(jiàn)表3。

觀察發(fā)現(xiàn)不同寄主抗感反應(yīng)差異明顯，其中鑒別寄主Iran H、Top mark、Vedrantais、Nantais Oblong接種白粉菌10 d發(fā)病，出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)近圓形粉狀斑點(diǎn)；20 d充分發(fā)病，整株植物葉片及莖干布滿白粉，感病嚴(yán)重。而寄主PMR45、PMR5、WMR29、Edisto47、PI414723、MR1、PI 124111、PI124112、PMR6葉片并未出現(xiàn)白粉菌侵染癥狀，表現(xiàn)較強(qiáng)抗病特征。對(duì)比表1抗感反應(yīng)，確認(rèn)南瓜基地白粉病病原菌生理小種為單囊殼白粉菌中的2France。

表3 鑒別寄主對(duì)南瓜白粉病菌抗感反應(yīng)Table3 Identification of hosts''resistanceto powdery mildew of pumpkin

2.5 病原菌鑒定在種質(zhì)資源開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用

利用分離純化的白粉菌2France生理小種對(duì)64份成株美洲南瓜種質(zhì)資源作接菌試驗(yàn)，接菌后20 d鑒定植株抗病等級(jí)，結(jié)果見(jiàn)表4。不同品系抗病情況不同。高感品系如圖6a和6b所示，基部老葉整片葉覆滿白粉，枯黃變脆，頂端嫩葉也散布白粉菌斑，主蔓和部分葉柄均有白粉菌斑附著；高抗品系植株無(wú)明顯菌斑（見(jiàn)6c和6d），葉片依然呈綠色。根據(jù)種質(zhì)資源抗病情況，0＜DI≤20時(shí)為高度抗病品系；80≤DI為高度感病品系。64份種質(zhì)資源中篩選出15份高感病品系和13份高抗病品系（見(jiàn)表4）。

圖6 種質(zhì)資源中高抗和高感品系Fig.6 Resistance and sensitive plants in Cucurbita pepo strains

表4 64份不同品系美洲南瓜接菌后抗病性鑒定Table 4 Reactions of resistance of 64 strains of Cucurbita pepo after infection

3 討論與結(jié)論

單囊殼白粉菌屬于白粉菌目（Erysiphales）白粉菌科（Erysiphaceae）單囊殼屬（Podosphaera），寄主范圍廣泛分布于黃瓜、南瓜、甜瓜、西瓜等作物上。感染葫蘆科白粉病病原菌在無(wú)性形態(tài)上不易區(qū)分，通過(guò)分生孢子是否具有纖維體方法區(qū)分P.xanthii（有纖維體）和E.cucurbitacearum（無(wú)纖維體），Ballantyne證實(shí)該區(qū)分方法準(zhǔn)確可行[13]。臧全宇通過(guò)有無(wú)纖維狀體鑒定杭州甜瓜白粉病屬于Podosphaera xanthii[14]。本研究觀察南瓜白粉病形態(tài)，分生孢子呈廣橢圓形，內(nèi)含纖維狀體，判斷其屬于單囊殼白粉菌（Podosphaera xanthii）。

rDNA序列克隆和分析手段廣泛應(yīng)用于病原菌分類。rDNA序列包括轉(zhuǎn)錄區(qū)和非轉(zhuǎn)錄區(qū)，轉(zhuǎn)錄區(qū)包括18S、5.8S、28SrDNA序列，而其中ITS序列進(jìn)化速度快，具有保守性，在不同科屬種水平上具有特異性，因此通過(guò)設(shè)計(jì)引物比對(duì)分析病原菌ITS序列可有效鑒定病原菌分類。張怡等通過(guò)分析小麥白粉菌ITS序列，認(rèn)為小麥白粉菌進(jìn)化可能與其小種進(jìn)化有關(guān)[11]。馬原松等分析河南白粉菌ITS序列，為病原菌系統(tǒng)分類鑒定及發(fā)育等研究提供依據(jù)[15]。本試驗(yàn)通過(guò)ITS序列比對(duì)及進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，南瓜白粉病菌與Podosphaera xanthii MUMH808，Podosphaera xanthii PM2， Podosphaera xanthii JG1，Podosphaera xanthii ET1，及Podosphaera xanthii PMJS1的ITS序列高度同源。同時(shí)通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，本試驗(yàn)中白粉菌與Podosphaera xanthii聚類在同一分支，進(jìn)一步確定南瓜白粉菌屬于單囊殼白粉菌（Podosphaera xanthii）。

白粉病菌生理小種種類多樣，分化快。同種植物不同時(shí)間致病生理小種不同。馬鴻艷等2008年調(diào)查東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝設(shè)施基地致病甜瓜白粉菌生理小種為單囊殼白粉菌2France，而2009～2010年2France未出現(xiàn)，其致病生理小種為單囊殼白粉菌race1和raceN1[9]。Mohamed等發(fā)現(xiàn)蘇丹夏季白粉菌優(yōu)勢(shì)小種為單囊殼白粉菌race1，冬季優(yōu)勢(shì)生理小種則為單囊殼白粉菌race2[16]。國(guó)內(nèi)不同地區(qū)同一作物感染生理小種不同。北疆地區(qū)甜瓜、籽用西瓜白粉菌生理小種及淮北市甜瓜白粉菌生理小種均為單囊殼白粉菌race1[17]。海南省三亞地區(qū)西甜瓜優(yōu)勢(shì)小種為單囊殼白粉菌2France。南疆地區(qū)甜瓜、籽用西瓜白粉菌生理小種則為單囊殼白粉菌race5[6]。不同設(shè)施栽培條件下，感染同種作物的生理小種不同。甘肅皋蘭縣什川鎮(zhèn)露地甜瓜致病菌為單囊殼白粉菌race1，而溫室甜瓜致病菌為單囊殼白粉菌2France。靖遠(yuǎn)縣東灣鎮(zhèn)露地甜瓜致病菌為單囊殼白粉菌race1，而大棚甜瓜致病菌為單囊殼白粉菌2France和race7[7]。白粉病菌生理小種進(jìn)化快，發(fā)病時(shí)期和發(fā)病地域不易確定，需及時(shí)、長(zhǎng)期鑒定生理小種，觀察其演替情況。因此本研究將連續(xù)多年監(jiān)測(cè)向陽(yáng)鎮(zhèn)南瓜基地，密切關(guān)注生理小種種類及分布變化。

近年來(lái)不同葫蘆科作物中抗白粉病種質(zhì)資源研究均有報(bào)道。馬鴻艷等鑒定109份甜瓜種質(zhì)抗白粉病情況，得到19份抗病材料，20份感病材料[18]。左洪波等鑒定51份黃瓜種質(zhì)資源材料白粉病抗性，得到3份高抗材料，未發(fā)現(xiàn)高感病材料[19]。劉鳴韜等鑒定38份南瓜種質(zhì)白粉病抗性，得到3份高抗材料，21份感病材料[20]。本研究利用鑒定出的白粉病病原菌接種64份南瓜種質(zhì)資源，得到高抗材料13份及高感材料15份。該研究為挖掘南瓜抗性種質(zhì)資源材料，抗病基因克隆及培育抗白粉病南瓜新品種等奠定基礎(chǔ)。