楊 龍, 劉芷含, 張瑞成, 馮 宇, 周延龍, 賈 瀟, 耿德勤, 程言博

小膠質(zhì)細(xì)胞(MG)的活化是中樞神經(jīng)系統(tǒng)觸發(fā)炎癥反應(yīng)的主要因素[1]。腦缺血以后,小膠質(zhì)細(xì)胞被活化,成為一把“雙刃劍”[2],起損傷和修復(fù)雙重效應(yīng),因此得到廣泛的關(guān)注。程序性壞死(Necroptosis)是一種caspases非依賴的細(xì)胞死亡方式,能被受體作用蛋白-1(RIP1)的別構(gòu)抑制劑Nec-1所抑制[3],Nec-1參與活化的小膠質(zhì)細(xì)胞的調(diào)控,能通過(guò)影響炎癥信號(hào)途徑而發(fā)揮抗炎作用[4,5]。我們前期研究發(fā)現(xiàn),Nec-1能使大鼠腦缺血再灌注時(shí),炎癥因子如白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)產(chǎn)生明顯減少[6]。但Nec-1在減輕缺血再灌注損傷進(jìn)程中炎癥反應(yīng)的具體信號(hào)通路及其調(diào)控機(jī)制尚不清楚。研究表明在MCAO模型中,TLR4、NF-κB和IL-6參與腦缺血再灌注損傷的過(guò)程[7,8]。Nec-1減輕腦缺血再灌注損傷后炎癥反應(yīng)和小膠質(zhì)細(xì)胞活化,是否與TLR4/NF-κB途徑以及IL-6有關(guān),目前文獻(xiàn)少有報(bào)道。因此,本研究擬通過(guò)線栓法制備大鼠MCAO模型,通過(guò)檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物iba-1以及TLR4、NF-κB和IL-6蛋白表達(dá)情況,探討Nec-1減輕大鼠腦缺血再灌注損傷后炎癥反應(yīng)和小膠質(zhì)細(xì)胞活化的可能機(jī)制,為缺血性腦血管病的治療提供新的靶點(diǎn)和思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年雄性SD大鼠96只,清潔級(jí),體重(250±10)g,由徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號(hào)：蘇SYXK2002-0038。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑及材料 MCAO栓線(北京沙東生物技術(shù)公司),Necrostatin-1(Selleckchem 公司),羊多克隆抗iba-1抗體、小鼠單克隆抗TLR4抗體(Abcam公司),兔多克隆抗IL-6抗體(藥科美生物技術(shù)有限公司),兔多克隆抗NF-κB/p65抗體(CST公司)。

1.2 方法

1.2.1 取SD大鼠48只，體重(250±10)g,按隨機(jī)數(shù)表法隨機(jī)分為Sham組、MCAO組、DMSO組、Nec-1干預(yù)組,每組再分兩個(gè)亞組,分別為再灌注6 h、24 h,每組6只。Nec-1組于缺血前30 min按640 nmol/kg側(cè)腦室注射Nec-1溶液(溶于10%DMSO溶液),DMSO組注射等量DMSO溶液。線栓法制備MCAO模型,于缺血2 h再灌注6 h和24 h,免疫組化染色檢測(cè)TLR4、NF-κB/p65和iba-1的免疫陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)。

1.2.2 另取48只SD大鼠，隨機(jī)分為Sham組、MCAO組、DMSO組、Nec-1干預(yù)組,每組再分兩個(gè)亞組,每組6只,于缺血2 h、再灌注6 h和24 h,WB檢測(cè)TLR4、NF-κB/p65、IL-6蛋白的定位和表達(dá)。

1.3 MCAO模型的建立 根據(jù)Longa線栓法制備MCAO模型[9]。將大鼠麻醉后固定,分離右側(cè)頸動(dòng)脈。結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端,遠(yuǎn)心端用動(dòng)脈夾阻斷血流,兩者之間剪一V形小口。將MCAO栓線沿V形口插人頸總動(dòng)脈,去掉動(dòng)脈夾,將栓線緩緩?fù)迫胫劣覀?cè)大腦中動(dòng)脈起始處,進(jìn)線深度約18～20 mm。結(jié)扎遠(yuǎn)心端固定栓線,常規(guī)消毒縫合切口,缺血2 h后拔除栓線行再灌注。

1.4 側(cè)腦室給藥參照文獻(xiàn)方法[10]。

1.5 神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分及納入排除標(biāo)準(zhǔn) (1)根據(jù)Longa方法[9]對(duì)腦缺血后2 h的大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。自由活動(dòng),沒有神經(jīng)功能障礙者,0分；提起大鼠尾巴左前肢屈曲者,1分；行走時(shí)地上打轉(zhuǎn),靜止時(shí)身體無(wú)偏向左側(cè)者,2分；行走時(shí)地上打轉(zhuǎn),靜止時(shí)身體也偏向左側(cè)者,3分；不能行走,嚴(yán)重意識(shí)障礙者,4分。(2)納入及排除標(biāo)準(zhǔn)：評(píng)分在1～3分的大鼠納入研究。因麻醉原因、手術(shù)操作及蛛網(wǎng)膜下腔出血造成的大鼠死亡和評(píng)分低于1分的大鼠予以排除,并隨機(jī)選取相同條件大鼠補(bǔ)充。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組織化學(xué)染色 與Sham組相比,MCAO組梗死周圍組織iba-1、TLR4、NF-κB/p65陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與 MCAO組相比,Nec-1組其陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；DMSO組與MCAO組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見圖1、表1、表2)。

2.2 Western blot結(jié)果 通過(guò)分析灰度值,Sham組梗死周圍組織有少量TLR4、IL-6表達(dá),細(xì)胞核內(nèi)有NF-κB/p65表達(dá)較低,MCAO組大鼠TLR4、IL-6和核內(nèi)NF-κB/p65的表達(dá)顯著增加；與MCAO組相比,Nec-1組TLR4、IL-6的表達(dá)量顯著減少,核內(nèi)NF-κB/p65的表達(dá)量顯著減少,核轉(zhuǎn)位減輕,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；DMSO組與MCAO組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見圖2、圖3)。

表1 I/R后6 h各組大鼠iba-1、TLR4、NF-κB/p65免疫陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)值比較(×10-3/μm2)

與Sham組相比*P<0.05；與MCAO組相比#P<0.05

表2 I/R后24 h各組大鼠iba-1、TLR4、NF-κB/p65免疫陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)值比較(×10-3/μm2)

與Sham組相比*P<0.05；與MCAO組相比#P<0.05

圖1 I/R后 6 h和24 h梗死周圍組織iba-1和TLR4免疫組化染色(Bar=20 μm,×400)

圖2 I/R后 6 h和24 h梗死周圍組織TLR4、IL-6蛋白表達(dá)結(jié)果

與Sham相比＊P<0.05；與MCAO組相比#P<0.05

圖3 I/R6 h和24 h梗死周圍組織胞核內(nèi)NF-κB/p65蛋白灰度值比較

3 討 論

小膠質(zhì)細(xì)胞的活化是中樞神經(jīng)系統(tǒng)觸發(fā)炎癥反應(yīng)的主要因素[1,4,5]。當(dāng)腦缺血再灌注時(shí),死亡的神經(jīng)細(xì)胞會(huì)釋放熱休克蛋白-60、透明質(zhì)酸、纖維蛋白原等內(nèi)源性配體,位與小膠質(zhì)細(xì)胞表面的TLR4則能結(jié)合這些配體,導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞活化[11],活化后會(huì)釋放大量炎性介質(zhì),引起繼發(fā)性神經(jīng)元損傷,從而形成惡性循環(huán)造成級(jí)聯(lián)放大效應(yīng),加重腦組織損傷。腦組織在發(fā)生可逆性缺血事件損傷后,又遭遇了不可逆的二次打擊：小膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度活化和炎性因子的大量釋放[12]。

正是由于缺血事件中的二次打擊,尋找一種新的藥物來(lái)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化,減輕炎癥反應(yīng)顯得尤為重要。抑制caspases活性可以通過(guò)靶向作用于小膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)起神經(jīng)保護(hù)作用[13],而程序性壞死是caspases非依賴的細(xì)胞死亡方式。有證據(jù)表明,體內(nèi)缺失受體相互作用蛋白3,則炎癥反應(yīng)消失,說(shuō)明炎癥反應(yīng)可能源自程序性壞死[14],且前期研究也發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注后,給予Nec-1干預(yù),炎性因子產(chǎn)生明顯減少[4,6,15],對(duì)腦組織起保護(hù)作用,這也對(duì)干預(yù)程序性壞死途徑抗炎治療提供了可能的依據(jù)。

RIP1是程序性壞死的關(guān)鍵激酶,其激酶活性對(duì)細(xì)胞壞死和凋亡起關(guān)鍵作用[16]；而Nec-1通過(guò)抑制RIP1激酶活性來(lái)保護(hù)神經(jīng)組織,可能與減輕下游炎癥反應(yīng)有關(guān)[15],在腦I/R模型中,Nec-1是通過(guò)何種途徑減輕炎癥反應(yīng)和小膠質(zhì)細(xì)胞活化來(lái)保護(hù)神經(jīng)組織,目前尚無(wú)確切研究結(jié)果。

有研究指出,RIP1是TLR3激活NF-κB信號(hào)通路中的基本介導(dǎo)物[17],但RIP1是否在TLR4激活NF-κB通路中起重要作用,目前文獻(xiàn)鮮有報(bào)道。因此本研究,通過(guò)觀察Nec-1對(duì)大鼠I/R后TLR4、NF-κB/p65、IL-6的表達(dá)的影響,探討Nec-1在大鼠I/R后小膠質(zhì)細(xì)胞活化中的意義,和可能的腦保護(hù)機(jī)制。

TLR4途徑對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活化和中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)調(diào)控居于核心地位,在腦內(nèi)主要由小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)。腦缺血時(shí),TLR4基因敲除的小鼠炎性因子產(chǎn)生明顯減少,腦組織損傷減輕[7]。TLR4 激活后主要通過(guò)兩條信號(hào)通路產(chǎn)生作用：髓樣分化因子88(MyD88)依賴信號(hào)通路和非MyD88依賴信號(hào)通路。MyD88依賴信號(hào)通路主要作用于NF-κB,其活化后可以促使TNF-α、IL-6等炎性介質(zhì)的分泌,引起免疫炎癥反應(yīng)[18]。問題是腦I/R時(shí),活化的小膠質(zhì)細(xì)胞調(diào)節(jié)TNF-α、IL-6等炎癥因子的表達(dá)是否通過(guò)對(duì)TLR4、NF-κB的調(diào)控而實(shí)現(xiàn)的？

我們前期研究發(fā)現(xiàn),腦缺血再灌注6 h后小膠質(zhì)細(xì)胞開始出現(xiàn)活化,至24 h后活化達(dá)到高峰[19]。因此本研究選擇再灌注6 h和24 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)。通過(guò)免疫組化和WB觀察到假手術(shù)組大鼠TLR4和核內(nèi)NF-κB表達(dá)極低,手術(shù)組表達(dá)明顯增高,證明TLR4/NF-κB信號(hào)途徑在大鼠缺血性腦損傷中起重要作用。TLR4升高的可能機(jī)制為：組織因缺血缺氧壞死產(chǎn)生的大量?jī)?nèi)源性配體如熱休克蛋白60、透明質(zhì)酸等,與TLR4結(jié)合,導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞活化,后者釋放大量炎性介質(zhì),作用于臨近的小膠質(zhì)細(xì)胞,引起中樞神經(jīng)炎癥與膠質(zhì)細(xì)胞激活的反饋環(huán),從而放大神經(jīng)毒性分子的產(chǎn)生引起繼發(fā)性神經(jīng)元損害；受損的神經(jīng)元因?yàn)檫@個(gè)二次打擊釋放更多的內(nèi)源性配體激活TLR4。Nec-1干預(yù)組較手術(shù)組表達(dá)降低,考慮可能機(jī)制有：Nec-1拯救死亡腦組織,使組織程序性壞死減少,小膠質(zhì)細(xì)胞表面TLR4內(nèi)源性配體減少；IL-6和TNF-α等促炎性因子表達(dá)減少,促炎性因子刺激新生小膠質(zhì)細(xì)胞活化減少,使炎癥反應(yīng)減輕。

此外,本研究還觀察到在缺血2 h,再灌注24 h,Nec-1預(yù)處理能明顯改善神經(jīng)功能缺損癥狀,TTC染色顯示腦梗死體積減小,并使腦水腫程度明顯減輕。因此我們可以推斷,在大鼠I/R損傷模型中,Nec-1通過(guò)拯救缺血腦組織的程序性壞死,使小膠質(zhì)細(xì)胞表面TLR4受體激活減少,至下游經(jīng)典轉(zhuǎn)錄因子NF-κB核移位減少,從而減輕腦缺血再灌注損傷后的炎癥反應(yīng),對(duì)腦組織起保護(hù)作用?；罨男∧z質(zhì)細(xì)胞通過(guò)necroptosis途徑分泌TNF-α、IL-6等因子可能是通過(guò)對(duì)TLR4、NF-κB的調(diào)控而實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述,盡管目前已發(fā)現(xiàn)程序性壞死某些調(diào)控炎癥的分子機(jī)制,但具體的信號(hào)機(jī)制尚不明確,TLR4信號(hào)通路介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化和炎癥因子的釋放是其重要機(jī)制之一。動(dòng)物在體模型中,TLR4、RIP1和NF-κB可能不是簡(jiǎn)單的上游與下游的關(guān)系,他們可能在促炎癥因子IL-6等的參與下,形成復(fù)雜交互的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系,起到相互調(diào)節(jié)的作用,RIP1在炎癥反應(yīng)中起中樞調(diào)控作用[20]。對(duì)TLR4及其信號(hào)通路進(jìn)行干預(yù),可能會(huì)為人類治療缺血性腦血管病后炎癥反應(yīng)提供新的思路。但是,本研究?jī)H局限于動(dòng)物在體模型中,另外沒有觀察對(duì)其他炎性因子和活性物質(zhì)表達(dá)的影響,這些均需要進(jìn)一步深入細(xì)致研究。