李 暉， 蔣 毅， 劉 穎

老年癡呆屬于神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，隨著我國人口老齡化現(xiàn)象加劇，其發(fā)病率逐年增加。由于多數(shù)患者不能及時得到有效治療導致其出現(xiàn)不同程度的認知障礙，嚴重影響患者本人的生活質(zhì)量，并且給其家庭帶來極大的經(jīng)濟負擔。因此，尋找有效診斷和治療老年癡呆的新靶點或新方法尤為重要。miRNA是一類小分子非編碼單鏈RNA分子，長度約為20～25個核苷酸，在基因轉(zhuǎn)錄、表達以及大量蛋白質(zhì)功能調(diào)控中發(fā)揮重要作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病如老年癡呆、帕金森病、胎兒畸形、抑郁癥等關(guān)系密切[2～4]。miR-9與miR-34c均參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程，與帕金森病等神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)[5,6]。老年癡呆與帕金森均為神經(jīng)退行性疾病，以神經(jīng)元變性為主要改變，細胞丟失是其共同特征，但miR-9和miR-34c在老年癡呆中的研究卻鮮有報道。本文通過檢測老年癡呆患者血清中miR-9和miR-34c表達，并分析其對老年癡呆的診斷價值，以期為老年癡呆的診斷治療提供新的方法。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年10月-2018年2月期間到本院治療的73例老年癡呆患者作為研究對象，男性46例，女性27例，年齡60～89歲，平均年齡(76.4±5.6)歲。納入標準：(1)符合美國精神病協(xié)會“精神障礙診斷和統(tǒng)計工作手冊第四版修正版”(DSM-Ⅳ-R)中關(guān)于癡呆診斷標準；(2)臨床癡呆分級量表(CDR)評定，評分>1分；(3)簡易精神狀態(tài)檢查量表(MMSE)<24分。排除標準：(1)有抑郁病史、精神分裂等精神類疾?。?2)合并高血壓、糖尿病患者；(3)心臟、肝、腎功能等嚴重受損、腦卒中、心肌梗死、貧血、聽覺障礙者；(4)資料不完整者。同時選取70例同一時期來我院體檢健康者作為正常組，男性38例，女性32例，年齡62～86歲，平均年齡(77.3±6.4)歲。兩組患者在性別、年齡、受教育程度方面比較無差異性(P>0.05)。本研究經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員會討論后批準，患者及家屬對本次研究均知情同意并簽署了知情同意書。

1.2 血樣采集及指標測定 采集所有受試者清晨空腹靜脈血5 ml，置于無菌促凝管中，靜置后離心收集上層血清，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩２捎妹阜z測所有研究者血清中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、脂聯(lián)素(ANP)、同型半胱氨酸(Hcy)含量，直接法檢測高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，所有試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，嚴格按照說明書進行操作。

1.3 RT-qPCR法檢測血清中miR-9和miR-34c的水平 按照miRNA試劑盒說明書對血清中miRNA進行提取，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以U6為內(nèi)參，進行檢測。反應(yīng)條件為：95 ℃預變性1 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，總共進行40個循環(huán)。內(nèi)參U6、miR-9和miR-34c引物序列(見表1)。

1.4 癡呆分級量表(CDR)評定 測評內(nèi)容包括記憶力、意動定向力、解析問題能力、社會事物認知、家居生活料理、業(yè)余習慣嗜好、個人自理狀況等。依據(jù)評分結(jié)果，分為健康(0分)、可疑癡呆(0.5分)、輕度癡呆(1分)、中度癡呆(2分)、重度癡呆(3分)。由同一位臨床經(jīng)驗豐富的精神科高年資醫(yī)師進行測評和匯總。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料比較 與正常組相比，老年癡呆患者血清TC水平上升、TG水平下降，但差異均不顯著(P>0.05)；LDL-C和Hcy水平顯著上升，HDL-C、ANP水平以及MMSE評分顯著下降，差異顯著(P<0.01)(見表2)。

表1 內(nèi)參U6、miR-9和miR-34c引物序列

表2 一般資料比較

與正常組比較*P<0.05

2.2 正常組與老年癡呆患者組血清中miR-9和miR-34c表達 與正常組相比，老年癡呆患者組血清中miR-9表達水平均明顯下降(P<0.01)，miR-34c表達水平均明顯上升(P<0.01)(見圖1)。

2.3 不同分組老年癡呆患者血清miR-9和miR-34c表達水平 依據(jù)CDR評分結(jié)果，將老年癡呆患者分為輕度癡呆、中度癡呆、重度癡呆3組，各組患者血清miR-9和miR-34c表達水平。隨著癡呆程度的加重，患者血清miR-9呈下降趨勢，miR-34c呈升高趨勢，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見表3)。

2.4 相關(guān)性分析結(jié)果 Pearson相關(guān)性分析表明：(1)老年癡呆患者血清中miR-9與血清LDL-C、Hcy水平均呈負相關(guān)，與HDL-C、ANP水平以及MMSE評分均呈正相關(guān)；(2)老年癡呆患者血清中miR-34c與血清LDL-C、Hcy水平均呈正相關(guān)，與HDL-C、ANP水平以及MMSE評分均呈負相關(guān)。相關(guān)系數(shù)(見表3)。

2.5 miR-9和miR-34c表達水平對老年癡呆的診斷價值 ROC分析結(jié)果顯示miR-9的敏感度為89.58%、特異度為80.00%、截斷值為0.87；miR-34c的敏感度為91.67%、特異度為71.11%、截斷值為1.14。結(jié)果(見圖1、表5)。

表3 不同分組老年癡呆患者血清miR-9和miR-34c表達水平比較

表4 miR-9和miR-34c與血清其他指標的相關(guān)性分析

表5 血清miR-9和miR-34c表達水平對老年癡呆ROC分析

圖1A:血清miR-9和miR-34c表達水平(與正常組相比*P<0.01);圖1B:血清miR-9和miR-34c表達的ROC曲線

3 討 論

我國老年癡呆患者人數(shù)達950萬多，位居全球第一位，預計到2050年，患者人數(shù)將達到三千多萬[7]。老年癡呆因其早期診斷困難，缺乏有效藥物，治療效果差，一直以來都是國內(nèi)外研究的熱門話題。積極尋找特異性早期診斷和治療的生物學標記物，尤其是血液當中的標記物是當前的重中之重。

有研究者對老年癡呆患者外周血細胞凋亡因子Fas/FasL研究發(fā)現(xiàn)其與患者發(fā)生癡呆呈正相關(guān)，可通過對患者外周血相關(guān)指標水平的測定判斷病情嚴重程度[8]。同型半胱氨酸(Hcy)是一種含硫基氨基酸，正常情況下，血同型半胱氨酸在體內(nèi)能被分解代謝，濃度維持在較低水平。當其表達異常會增加冠心病、外周血管疾病及腦血管疾病的發(fā)病風險。有研究表明，老年癡呆患者外周血中Hcy水平明顯升高，是造成發(fā)病的危害因素[9]。本研究結(jié)果表明老年癡呆患者Hcy水平高于健康人體，提示Hcy可能與老年癡呆的發(fā)生相關(guān)，為臨床治療和預防癡呆提供新思路，從降低Hcy水平入手，可能有助于延緩老年癡呆病情進展。有研究表明高血脂與老年性癡呆的發(fā)生相關(guān)，本研究結(jié)果表明老年癡呆患者LDL-C水平明顯上升，HDL-C水平明顯下降，與相關(guān)文獻報道的結(jié)果一致[10]，提示LDL-C和HDL-C在老年性癡呆病情程度鑒別當中可作為參考指標。ANP是脂肪組織分泌的蛋白，有研究報道稱血清中高濃度的ANP可以改善保護老年癡呆患者的認知功能[11]，本研究表明老年癡呆患者血清ANP水平明顯低于健康人體，與相關(guān)研究報道一致[12]，提示ANP與老年癡呆的發(fā)生、發(fā)展過程相關(guān)。

miRNA是一類小分子非編碼單鏈RNA分子，能夠在后轉(zhuǎn)錄水平通過堿基互補配對的方式與靶信使RNA的3’端非翻譯區(qū)結(jié)合抑制該mRNA的翻譯過程或使mRNA降解，進而影響相關(guān)基因表達[13]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA參與細胞生長、分化等生命過程，與多種疾病發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[14]。除此之外，miRNA表達組織特異性較好，穩(wěn)定性較高，具有以下優(yōu)點：第一，血清樣本易得，花費成本較小；第二，miRNA能在強酸、強堿等極端條件及溫度下長期存放，幾乎不受外界環(huán)境干擾；第三，為非侵入性檢測指標，對人體無其他傷害作用[15]。miR-9屬于miRNA家族重要成員之一，有兩種存在形式：前體miR-9和成熟miR-9，僅有成熟的miR-9才能夠在生物體中發(fā)揮重要的功能[16]。研究表明，miR-9可能通過抑制鋅指蛋白521表達，促進BMSCs向神經(jīng)細胞分化[17]；miR-9可能通過調(diào)控突觸小泡磷酸酶1和突觸孔蛋白等基因表達影響神經(jīng)元間突觸傳遞遞質(zhì)的功能，從而影響神經(jīng)元活性[18]。本研究結(jié)果表明，老年癡呆患者血清中miR-9表達水平比正常健康人顯著下降，說明癡呆患者miR-9水平呈低表達，miR-9可能通過抑制神經(jīng)元分化影響老年癡呆發(fā)展過程。ROC結(jié)果顯示miR-9的敏感度為89.58%、特異度為80.00%、截斷值為0.87，說明檢測患者血清miR-9的相對表達量低于0.87時極可能已發(fā)生老年癡呆，推測miR-9可能為臨床診斷老年癡呆的重要血清標志物。

miR-34同樣是miRNA家族的重要成員，在哺乳動物基因中，miR-34有3個成員，miR-34a、miR-34b、和miR-34c。其中miR-34c定位于染色體11q23，與學習記憶的形成相關(guān)，是認知功能的潛在調(diào)控因子[19]。miR-34c與海馬記憶功能相關(guān)，其高度表達能夠調(diào)控一些與記憶形成相關(guān)的基因。研究發(fā)現(xiàn)，miR-34c在海馬神經(jīng)元中過表達負向調(diào)節(jié)樹突長度和脊柱密度，用miR-34c轉(zhuǎn)染的海馬神經(jīng)元樹突較短，絲狀偽足和脊柱較少[20]。因為樹突和突觸是信號轉(zhuǎn)導的關(guān)鍵位點、記憶形成和儲存的基本結(jié)構(gòu)，樹突受到損傷后易引發(fā)老年癡呆。因此，miR-34c通過影響樹突和突觸，造成老年癡呆患者學習記憶障礙。小鼠海馬被注射miR-34c抑制劑后，SIRT1的表達回復至生理學水平，在老年鼠中降低miR-34c表達后，SIRT1的表達同樣恢復至生理水平，且小鼠的學習行為也得到了改善[21]。本研究結(jié)果表明老年癡呆患者血清中miR-34c表達水平顯著升高，與患者MMSE評分負相關(guān)，推測其上調(diào)促進了SIRT1的表達，進而使患者認知功能出現(xiàn)障礙，有待進行更深入探討。ROC分析結(jié)果顯示miR-34c具有較高的敏感性及特異性，推測miR-34c可作為臨床診斷老年癡呆的預測因子之一。本研究結(jié)果顯示老年癡呆患者組血清miR-9和miR-34c水平與Hcy、ANP、患者精神狀態(tài)評分等均相關(guān)，且依據(jù)CDR評分，患者癡呆程度越嚴重，miR-9水平越低，miR-34c水平越高，提示miR-9和miR-34c水平能反應(yīng)癡呆程度。

綜上所述，測定老年癡呆患者血清中miR-9和miR-34c表達水平，對于診斷、治療老年癡呆患者具有一定的參考價值，但本研究由于受樣本數(shù)量較少、患者自身基礎(chǔ)疾病等因素的影響，研究結(jié)果可能具有一定的偏差，后續(xù)需要擴大樣本量，排除其他因素的影響，對miR-9和miR-34c表達異常的機制等進行更深入的研究。