羅瑋、劉超綜述，叢洪良審校

隨著我國(guó)風(fēng)濕熱發(fā)病率逐年下降，鈣化性主動(dòng)脈瓣膜病（CAVD）成為老年人最常見(jiàn)的心臟瓣膜病，且隨著人們生活方式、人口老齡化、科學(xué)技術(shù)和健康產(chǎn)業(yè)的發(fā)展而呈現(xiàn)出逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)。最近的研究發(fā)現(xiàn)，CAVD 是涉及內(nèi)皮損傷、脂質(zhì)浸潤(rùn)、慢性炎癥、基質(zhì)重構(gòu)、細(xì)胞分化、鈣鹽沉積及新生血管形成等復(fù)雜變化的主動(dòng)過(guò)程，對(duì)CAVD 發(fā)病機(jī)制的研究有可能使藥物治療延緩或逆轉(zhuǎn)CAVD 的發(fā)展成為可能。

1 CAVD 發(fā)病機(jī)制

主動(dòng)脈瓣葉分三層，各層由瓣膜間質(zhì)細(xì)胞（VIC）、細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）以及瓣膜內(nèi)皮細(xì)胞（VEC）組成，沒(méi)有血管組織。Venardos 等[1]發(fā)現(xiàn)應(yīng)用Toll樣受體4（TLR-4）分別對(duì)培養(yǎng)的正常主動(dòng)脈瓣、二尖瓣、肺動(dòng)脈瓣和三尖瓣VIC 進(jìn)行促炎性刺激，結(jié)果顯示只有主動(dòng)脈瓣VIC 受刺激后發(fā)生成骨樣分化，其余瓣膜VIC 不發(fā)生成骨分化，提示主動(dòng)脈瓣VIC成骨分化可能是CAVD 發(fā)病的重要基礎(chǔ)，而對(duì)VIC的調(diào)控很大程度上是通過(guò)瓣膜內(nèi)皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞傳遞的[2]。

1.1 內(nèi)皮損傷與慢性炎癥

內(nèi)皮細(xì)胞層遭到破壞之后，淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，瓣膜內(nèi)氧化低密度脂蛋白積累，炎癥信號(hào)通路激活，VIC 增生活化是引起瓣膜鈣化的重要起點(diǎn)。Wang 等[3]研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞激活后釋放的炎性因子高遷移率族蛋白1（HMGB1），可以引起更多的促炎因子的釋放，同時(shí)磷酸化激活c-Jun 氨基末端激酶-絲裂原活化激酶（JNK-MAPK）信號(hào)系統(tǒng)，而抑制JNK-MAPK 信號(hào)系統(tǒng)磷酸化可以阻滯VIC 的成骨表型轉(zhuǎn)化及礦化，從而得出結(jié)論，HMGB1 通過(guò)TLR4-JNK-核轉(zhuǎn)錄因子κ B（NF-κB）途徑促進(jìn)CAVD 的進(jìn)展。

1.2 細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化及異位鈣化

剪切應(yīng)力、機(jī)械變形、ECM 重塑和炎癥刺激引起內(nèi)皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（EndMT），有研究通過(guò)將氨基葡聚糖硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸等加入到3D膠原水凝膠中對(duì)微環(huán)境的變化進(jìn)行模擬，觀察其對(duì)EndMT 的影響，發(fā)現(xiàn)高水平的氨基葡聚糖硫酸軟骨素誘導(dǎo)了最高的EndMT 轉(zhuǎn)化率，并通過(guò)間質(zhì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生了最多的膠原蛋白，這表明細(xì)胞表型最有可能促進(jìn)纖維性疾病[4]。發(fā)生EndMT 的細(xì)胞同時(shí)表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD31，又稱(chēng)為血小板-內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子（PECAM-1/CD31）和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）。在鈣化性主動(dòng)脈瓣疾病中，VEC 通過(guò)EndMT 修補(bǔ)受傷的成人瓣葉并在此過(guò)程中進(jìn)行成骨分化，VEC 經(jīng)由轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）介導(dǎo)發(fā)生EndMT 后測(cè)定其α-SMA、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）的信使mRNA 表達(dá)顯著增強(qiáng)，并且這一過(guò)程可以被VIC 抑制[5]。

升高的低密度脂蛋白與動(dòng)脈粥樣硬化（AS）及CAVD 的關(guān)系已被證實(shí)，動(dòng)物研究表明脂質(zhì)通過(guò)激活細(xì)胞信號(hào)通路Wnt /低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5（LRP5）發(fā)揮重要的作用[6]，在瓣膜發(fā)育成熟后，升高的低密度脂蛋白通過(guò)與LRP5/6 結(jié)合，進(jìn)而引起瓣膜細(xì)胞增殖分化發(fā)生成骨反應(yīng)，最終導(dǎo)致CAVD[7]。

1.3 骨代謝異常

鈣化的主動(dòng)脈瓣中，會(huì)出現(xiàn)異位骨化，骨保護(hù)蛋白細(xì)胞因子系統(tǒng)即骨保護(hù)素（OPG）/NF—κB受體活化因子配基（RANKL）/RANK 系統(tǒng)參與了這一過(guò)程。對(duì)60 例主動(dòng)脈瓣狹窄的患者，留取其置換的瓣膜組織，根據(jù)鈣化程度分為鈣化組和非鈣化組，通過(guò)測(cè)定兩組間血清OPG、RANKL、骨鈣素、腫瘤壞死因子α（TNFα）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）和IL-6 的水平，發(fā)現(xiàn)瓣膜鈣化的患者OPG（P=0.0006）和TNFα（P=0.02）水平較低，且較少患糖尿?。≒=0.04），其瓣膜顯示出較高的骨化發(fā)生率（P=0.002）及降低的脂質(zhì)積累（P=0.04）。在多元分析中，血循環(huán)中低OPG 水平和未患糖尿病是瓣膜鈣化的預(yù)測(cè)因子[8]。由于CAVD 的發(fā)病機(jī)制與動(dòng)脈粥樣硬化基本一致，但是有大約50%的CAVD 患者并不伴隨有明顯的動(dòng)脈粥樣硬化，F(xiàn)ojt 等[9]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)量鈣化狹窄的主動(dòng)脈瓣組織的OPG 水平并研究其與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)從105 位CAVD 的患者中收集主動(dòng)脈瓣樣本，并根據(jù)冠狀動(dòng)脈是否存在50%以上狹窄將其分為：A 組冠狀動(dòng)脈正常組，B 組冠狀動(dòng)脈狹窄組，并入選即無(wú)主動(dòng)脈瓣狹窄也無(wú)冠狀動(dòng)脈狹窄的患者設(shè)為C 組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)A 組瓣膜組織中OPG 水平最高，B 組和C組的瓣膜組織中OPG 水平?jīng)]有顯著性差異，這與之前所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)B 組循環(huán)血中OPG 水平最高有所不同，提示循環(huán)血中OPG 濃度的增高抑制了局部瓣膜組織OPG 的生成，而局部組織中的高OPG 濃度抑制了破骨細(xì)胞的活性，加重了瓣膜鈣化的進(jìn)展。

2 DNA 甲基化與鈣化性主動(dòng)脈瓣膜病

DNA 甲基化是指以s-腺苷甲硫氨酸（SAM）為甲基供體，經(jīng)DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）的調(diào)節(jié)，將供體的甲基轉(zhuǎn)移到5’端Cp G 二核苷酸的胞嘧啶上，使之變?yōu)?-甲基胞嘧啶。基因的表達(dá)程度與Cp G 島甲基化狀態(tài)密切相關(guān)，高表達(dá)基因趨向于低甲基化狀態(tài)，而沉默基因則呈高甲基化狀態(tài)，即DNA 甲基化與基因表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，異常的DNA甲基化模式是許多疾病共同的分子學(xué)基礎(chǔ)。

2.1 DNA 甲基化與心血管疾病

心血管疾病中普遍存在著DNA 甲基化修飾， AS及鈣化過(guò)程中相關(guān)基因的DNA 甲基化異常是最近的研究熱點(diǎn)之一。MMPs 能特異性與細(xì)胞外基質(zhì)成分相結(jié)合并降解細(xì)胞外基質(zhì)，目前發(fā)現(xiàn)在不穩(wěn)定性心絞痛、急性心肌梗死以及頸動(dòng)脈狹窄患者中，血漿MMP-2 濃度升高[10]。Chen 等[11]發(fā)現(xiàn)，微小RNA-29b（microRNA-29b，miRNA-29b）通過(guò)抑制DNA甲基化關(guān)鍵酶DNMT3b 的表達(dá)，間接降低MMP-2/MMP-9 基因的甲基化水平，促進(jìn)了MMP-2/MMP-9的表達(dá)，從而極大地促進(jìn)了人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（HASMC）細(xì)胞的遷移，MMP-2、MMP-9 基因低甲基化可能是動(dòng)脈粥樣硬化的一種潛在機(jī)制。

終末期腎病（ESRD）患者血管鈣化發(fā)生率高，最新研究證實(shí)ESRD 患者普遍存在血管鈣化和血管局部Klotho 基因超甲基化，Chen 等[12]采用硫酸吲哚酚聯(lián)合5/6 腎切除建立尿毒癥大鼠血管鈣化模型，并通過(guò)茜素紅鈣鹽沉積染色觀察了硫酸吲哚酚組胸主動(dòng)脈的血管鈣化程度，采用免疫組織化學(xué)染色和Westen Blot 觀察了胸主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞表型標(biāo)志物α-SMA 和成骨轉(zhuǎn)化相關(guān)基因骨橋蛋白的表達(dá)水平后得出結(jié)論，硫酸吲哚酚通過(guò)上調(diào)血管平滑肌細(xì)胞DNMT1 及DNMT3a 的表達(dá)，啟動(dòng)Klotho 基因超甲基化，進(jìn)而下調(diào)Klotho 基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞成骨轉(zhuǎn)化和血管鈣化。

在9p21 染色體附近的細(xì)胞依賴(lài)性激酶抑制劑2a/2b（CDKN 2a/2b）與動(dòng)脈粥樣硬化和動(dòng)脈鈣化有關(guān)，而CDKN2a/2b 是一個(gè)經(jīng)常被報(bào)道的DNA 甲基化位點(diǎn)，Zhou 等[13]等測(cè)量322 位缺血性卒中患者的外周血白細(xì)胞中CDKN 2a/2b 的DNA 甲基化水平，發(fā)現(xiàn)CDKN2b 的甲基化水平與頸動(dòng)脈鈣化分?jǐn)?shù)的立方根（β=0.591±0.172，P=0.001）呈正相關(guān)，提示CDKN2b的DNA甲基化可能在動(dòng)脈鈣化中發(fā)揮作用。

2.2 DNA 甲基化與主動(dòng)脈瓣鈣化

CAVD 是長(zhǎng)期發(fā)展的慢性過(guò)程，由于累及的組織器官均己分化成熟，所以基因和染色體的修飾如DNA 甲基化、組蛋白的乙?；缺碛^遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制可能起主要的作用，并且與動(dòng)脈粥樣硬化相似的發(fā)病機(jī)制也為此推測(cè)提供可能性并在近期的研究中得到證實(shí)。

Nagy 等[14]比較了正常和鈣化的人主動(dòng)脈瓣組織發(fā)現(xiàn)，鈣化的組織在促炎酶5-脂氧基酶（5-LOX）基因編碼的啟動(dòng)子中DNA 甲基化減低，同時(shí)5-LOX mRNA 水平升高。用DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷（5-Aza-2dC）作用于培養(yǎng)的VIC，也發(fā)現(xiàn)5-LOX mRNA 的水平升高和白三烯的產(chǎn)生。這些發(fā)現(xiàn)提供了在瓣膜性心臟病中對(duì)VIC 的表觀遺傳修飾的一個(gè)證據(jù)。主動(dòng)脈瓣的成骨活性是在Notch1 的控制下進(jìn)行的，它調(diào)節(jié)Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（RUNX2）和骨形成蛋白-2（BMP-2）等基因表達(dá)的改變。研究發(fā)現(xiàn)在鈣化性主動(dòng)脈瓣疾病中長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA） H19 的表達(dá)增加，而其啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化程度與H19 的表達(dá)成反比，H19 通過(guò)改變Notch1 途徑誘發(fā)VIC 成骨表型的轉(zhuǎn)化。在H19缺失的VIC 中，NOTCH1 的表達(dá)增強(qiáng)，而RUNX2和BMP-2 的水平降低。這些發(fā)現(xiàn)表明，在CAVD 中，H19 的啟動(dòng)子中DNA 甲基化的失調(diào)，與lncRNA 的表達(dá)有關(guān)，后者通過(guò)干擾Notch1 的表達(dá)來(lái)促進(jìn)成骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[15]。

現(xiàn)已證實(shí)，參與骨鈣化的信號(hào)通路如Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號(hào)通路、OPG/RANKL/RANK信號(hào)通路也同樣對(duì)主動(dòng)脈瓣鈣化進(jìn)行調(diào)節(jié)[16-17]，并且Wnt/β-catenin 信號(hào)通路、OPG/RANKL/RANK 信號(hào)通路均發(fā)現(xiàn)存在DNA 甲基化修飾的證據(jù)。

Wnt 與跨膜受體家族（FZD）及LRP5/6 結(jié)合為共受體后，Wnt 信號(hào)通路激活,使β-catenin 穩(wěn)定，穩(wěn)定的β-catenin 轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，與淋巴增強(qiáng)子結(jié)合因子（LEF）及T 細(xì)胞因子（TCF） 結(jié)合,激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化增生[18]。因此Wnt通路某些基因表達(dá)受到調(diào)控，即能調(diào)控成骨細(xì)胞的增生、分化，影響骨轉(zhuǎn)換。在骨質(zhì)疏松的過(guò)程中，間葉細(xì)胞（MSC）向脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)化會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)量和脂肪的不平衡，從而增加骨折的風(fēng)險(xiǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松患者的MSC 中增強(qiáng)子（EZH2）的表達(dá)明顯增加，EZH2 直接增加了Wnt1、Wnt6 和Wnt10a 的啟動(dòng)子的甲基化水平，從而抑制Wnt 基因轉(zhuǎn)錄，對(duì)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的抑制，促進(jìn)了MSC 向脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。通過(guò)使用EZH2 抑制劑，在體外促進(jìn)了成骨細(xì)胞分化，在患骨質(zhì)疏松的小鼠體內(nèi)成功地增加了骨形成，抑制了過(guò)量的骨髓脂肪的形成[19]。

OPG 與RANK 特異性結(jié)合，抑制破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的分化和成熟破骨細(xì)胞的骨吸收，并誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡，從而抑制破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收。RANK 與RANKL 特異性結(jié)合可刺激破骨細(xì)胞前體細(xì)胞分化，活化成熟破骨細(xì)胞，阻止破骨細(xì)胞凋亡并延長(zhǎng)其壽命，促進(jìn)骨吸收[20]。Delgado-calle 等[21]在人的骨組織上發(fā)現(xiàn)存在RANKL 和OPG 基因甲基化的現(xiàn)象，并證實(shí)5-Aza-dC 可以降低RANKL和OPG 基因甲基化，使RANKL 和OPG 表達(dá)增加。Nishikawa 等[22]發(fā)現(xiàn)，DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶3a 能夠通過(guò)偶聯(lián)SAM 介導(dǎo)的代謝途徑，抑制抗破骨細(xì)胞形成基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化，該代謝過(guò)程涉及RANKL 通路相關(guān)基因甲基化的改變。研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5（PRMT5）在破骨細(xì)胞分化過(guò)程中表達(dá)增強(qiáng)，抑制PRMT5 通過(guò)甲基化調(diào)節(jié)，降低趨化因子C-X-C 基配體10（CXCL10）及抗病毒蛋白R(shí)SAD2 的表達(dá)，從而導(dǎo)致RANKL 的抑制并最終抑制破骨細(xì)胞分化，防止卵巢切除術(shù)后的骨丟失[23]。

由于CAVD 晚期的發(fā)病機(jī)制與骨形成類(lèi)似，因此是否可以推測(cè)，DNA 甲基化修飾同樣參與了主動(dòng)脈瓣膜的主動(dòng)異位鈣化過(guò)程。

綜上所述，CAVD 是復(fù)雜的多因素參與的主動(dòng)調(diào)節(jié)過(guò)程，其發(fā)病機(jī)制包含內(nèi)皮損傷、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化及異位鈣化等復(fù)雜改變，涉及BMP2/Smads/RUNX2、Notch、Wnt/β-catenin、NF-κB 和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶-1（ERK1）/ERK2及OPG/RANKL/RANK等多信號(hào)通路[24-25]。盡管如此，作為一種遺傳因素與環(huán)境因素相互作用，涉及復(fù)雜細(xì)胞分子學(xué)機(jī)制的慢性進(jìn)展性疾病，其確切的發(fā)病機(jī)制尚不明確。對(duì)CAVD 發(fā)病機(jī)制及其信號(hào)通路中相關(guān)基因的甲基化修飾研究，為從分子學(xué)水平研究CAVD 的發(fā)病機(jī)制提供了新途徑，從而對(duì)疾病的預(yù)防及治療提供更有效的手段。