樊 凡 方 成

(武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，武漢430023)

近年報(bào)道7種新型佐劑被批準(zhǔn)用于人用疫苗：病毒樣顆粒(Virus-like particles，VLPs)、基于角鯊烯乳劑(MF59)、咪喹莫特(Imiquimod)、雷西莫特(Resiquimod)、AS01(AS，Adjuvant system)、AS03和AS04，其中復(fù)合佐劑的占比接近一半，復(fù)合化已成為佐劑發(fā)展的一大趨勢[1]?，F(xiàn)對復(fù)合佐劑的研究現(xiàn)狀做一綜述。

1 以鋁鹽為載體的復(fù)合佐劑

鋁鹽佐劑作為世界上首次批準(zhǔn)的人用疫苗佐劑，已使用了90年[2]。鋁鹽具有較大的表面積和較高的電荷密度，可將抗原吸附在表面。雖然鋁鹽可提高疫苗的抗體滴度，但沒有證據(jù)表明可增強(qiáng)細(xì)胞免疫。而增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答對多種疾病的防疫十分必要。因此將細(xì)胞免疫刺激物吸附在鋁鹽上是復(fù)合佐劑的重要策略。

1.1鋁鹽+Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)配體[單磷酰脂質(zhì)A(Monophosphoryl lipid A，MPL)] 2009年美國批準(zhǔn)的人類乳頭狀瘤病毒16/18(Human papillomavirus-16/18，HPV-16/18)疫苗以AS04為佐劑，它是由TLR4配體MPL吸附于氫氧化鋁構(gòu)成。AS04較鋁鹽可以誘導(dǎo)更高水平的HPV特異性抗體和記憶B細(xì)胞[3]。AS04在注射部位短暫激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB[4]，誘導(dǎo)IL-2和IFN-γ的產(chǎn)生[1]。在24 h內(nèi)，AS04直接觸發(fā)樹突狀細(xì)胞和單核細(xì)胞提呈抗原并向淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[5]。AS04對抗原提呈細(xì)胞(Antigen presenting cell，APC)快速而短暫的刺激使其能夠處理高濃度抗原[6]。AS04也被用于乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)疫苗[7]。將TLR4配體脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)加入以鋁為基礎(chǔ)佐劑的破傷風(fēng)類毒素疫苗，發(fā)現(xiàn)LPS增加了IgG1和IgG2a抗體的產(chǎn)生，同時(shí)減少TH2型免疫反應(yīng)，但TLR4配體MPL降低TH2反應(yīng)的效果較弱[8]。

1.2鋁鹽+TLR4配體(CIA05) CIA05是一種來源于LPS突變體的TLR4激動劑，被證明使小鼠脾細(xì)胞增強(qiáng)表達(dá)抗HBV表面抗原的抗體和IFN-γ[9]。它與鋁鹽合用可增加血清中抗炭疽保護(hù)性抗原抗體和毒素中和抗體的滴度[10]。CIA05和鋁鹽按1∶50的比例組成的復(fù)合佐劑稱為CIA06，以其為佐劑的HPV疫苗誘導(dǎo)的抗原特異性IgG抗體滴度、脾IFN-γ的分泌和記憶B細(xì)胞在免疫后24周仍然保持高水平[11]。

1.3鋁鹽+TLR9配體[CpG寡脫氧核苷酸(Oligodeoxynucleotide，ODN)] CpG ODN是在細(xì)菌基因組中發(fā)現(xiàn)的可被TLR9識別的核苷酸序列。B類CpG ODN可強(qiáng)烈刺激人B細(xì)胞和單核細(xì)胞的成熟，而被用于疫苗佐劑[12]。CpG+鋁鹽的組合用于HBV疫苗、炭疽疫苗和流感疫苗，縮短了保護(hù)性水平抗體產(chǎn)生的時(shí)間并且升高抗體滴度，誘導(dǎo)IFN-γ表達(dá)，激活Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答[13-15]。還能減少疫苗劑量，且CpG+鋁鹽的組合具有良好的耐受性。CpG和鋁鹽與丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)重組抗原聯(lián)用，可通過增加漿細(xì)胞的數(shù)量，提高免疫反應(yīng)的效率，增強(qiáng)小鼠的體液免疫[16]。Tian等[17]發(fā)現(xiàn)將抗原與鋁鹽-CpG-天然免疫調(diào)節(jié)肽(Innate defense regulator peptide，IDR)-HH2組合佐劑共同施用明顯激活NK細(xì)胞毒性，誘導(dǎo)抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，顯著引發(fā)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic lymphocyte，CTL)應(yīng)答，并增加腫瘤中的浸潤淋巴細(xì)胞，有效抑制腫瘤生長并減少腫瘤負(fù)荷。Mirotti等[18]發(fā)現(xiàn)在卵清蛋白致過敏性肺炎模型中，鋁鹽/CpG具通過MyD88和IL-10改變鋁佐劑所誘發(fā)的單一TH2型應(yīng)答，導(dǎo)致平衡的TH1/TH2型免疫反應(yīng)。

1.4鋁鹽+TLR7/8配體(3M-052) 磷酸基或陰離子電荷可促進(jìn)對氫氧化鋁的吸附，與TLR4配體(通常含有磷酸基)或TLR9配體(帶負(fù)電荷)相比，其他的模式識別受體(Pattern recognition receptor，PRR)配體比如TLR7/8激動劑Imiquimod不包含這種促進(jìn)吸附的結(jié)構(gòu)。對于不溶性脂質(zhì)PRR配體來說，處理更加復(fù)雜，必須在與鋁鹽進(jìn)行吸附之前，先將其配制成水懸液。Vasilakos等[19]開發(fā)了一種不溶性的合成TLR4配體—葡萄糖脂質(zhì)A(Glucopyranosyl lipid A，GLA)的水納米懸浮體(Aqueous formulation，AF)GLA-AF，并與磷脂酰膽堿結(jié)合，其通過磷酸配體交換來吸附氫氧化鋁。Cortez 等[20]也通過用磷酸鹽化學(xué)修飾TLR7激動劑苯并萘啶，使其可吸附于鋁鹽。

Fox等[21]提出了一種假設(shè)：輔助脂質(zhì)可以促進(jìn)不溶性PRR配體對氫氧化鋁的吸附。即使PRR配體不含磷酸鹽或其他陰離子基團(tuán)，并用3M-052-AF(TLR7/8配體3M-052和輔助脂質(zhì)二甲酰甘油酯的水納米懸浮液)和鋁鹽聯(lián)合肺結(jié)核抗原或HIV抗原，證明可以增強(qiáng)抗體水平和TH1型細(xì)胞免疫。

2 以乳劑為載體的復(fù)合佐劑

PELC是一種新型的納米乳劑，由生物可吸收的聚合物PEG-b-PLACL、Span85和角鯊烯組成[22]。Huang等[23]證明了PELC在模擬體內(nèi)環(huán)境可降解并具耐受性，所荷載的抗原在基質(zhì)中持續(xù)釋放，誘導(dǎo)高濃度的特異性抗體的產(chǎn)生，并極大地增強(qiáng)抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答。此外，PELC不僅將APC募集到注射部位，而且還誘導(dǎo)募集的APC活化并遷移到引流淋巴結(jié)。Chen等[24]發(fā)現(xiàn)相比于鋁劑，PELC/CpG能使重組H7HA(rH7HA)亞單位疫苗引發(fā)更高的病毒中和抗體表達(dá)，并且在脾中誘導(dǎo)更多的H7HA特異性IFN-γ分泌性T細(xì)胞和抗體分泌細(xì)胞，提高機(jī)體對H7N9型禽流感病毒的免疫能力。PELC/CpG佐劑還可用于一種新的腫瘤相關(guān)抗原L6的B細(xì)胞表位及CTL、TH表位嵌合長肽的配制，這種合成肽可應(yīng)用于癌癥免疫治療[25]。

此外一種新型的O/W納米乳劑(Nanoemul-sion，NE)W805EC，由大豆油(64%)和十六烷基吡啶(1%)、吐溫80(5%)和乙醇(8%)在水中高速乳化制成，且平均粒徑為350 nm。NE是一種新型黏膜佐劑，可誘導(dǎo)強(qiáng)大的IgA和IgG抗體反應(yīng)以及特有的TH1/TH17細(xì)胞免疫。在基因敲除的小鼠中發(fā)現(xiàn)其可能同時(shí)通過TLR依賴和非依賴性的途徑來誘導(dǎo)適應(yīng)性體液和細(xì)胞免疫[26]。Bielinska等[27]通過用鋁佐劑使乙肝表面抗原在小鼠肌肉內(nèi)免疫建立TH2免疫應(yīng)答，隨后用NE-乙肝表面抗原免疫一次，發(fā)現(xiàn) TH1相關(guān)免疫應(yīng)答和IL-17表達(dá)增多，TH2細(xì)胞因子(IL-4和IL-5)和IgG1降低。NE免疫誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和IL-10，且IL-10是抑制TH2免疫的。這表明基于NE的疫苗可以降低已有的TH2免疫應(yīng)答并促進(jìn)TH1/TH17免疫應(yīng)答。

3 以脂質(zhì)體為載體的復(fù)合佐劑

脂質(zhì)體是由膽固醇和磷脂組成的單個或多個雙分子膜囊，無免疫刺激作用和毒性，可被生物降解。抗原可鑲嵌在膜表面或包裹在膜內(nèi)，發(fā)揮倉庫效應(yīng)和靶向作用。免疫增強(qiáng)性重組流感病毒體(Immunopotentiating reconstituted influenza virosomes,IRIV)由70%的磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺(構(gòu)成磷脂雙分子層)和30%的提純于流感病毒中的糖蛋白血凝素(Hemagglutinin，HA)、神經(jīng)氨酸酶(Neuramini-dase，NA)(插在磷脂膜表面)組成[28]。HA與巨噬細(xì)胞的唾液酸受體結(jié)合，介導(dǎo)抗原進(jìn)入由HA觸發(fā)膜融合巨噬細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，NA可降低宿主黏液的黏性，使抗原更易接近宿主上皮細(xì)胞[29]。IRIV已經(jīng)應(yīng)用于流感疫苗和甲型肝炎疫苗中，甲肝抗原經(jīng)純化、滅活后結(jié)合在IRIV磷脂膜表面。

免疫刺激復(fù)合物是由皂苷、膽固醇、磷脂組成的直徑約30～40 nm的脂質(zhì)小泡，可促進(jìn)抗原的呈遞，增加抗體滴度的同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，現(xiàn)已用于多種疫苗如 HIV疫苗、流感疫苗等[30]。Fox等[31]通過將TLR7的配體Imiquimod置于脂質(zhì)體內(nèi)部，將TLR4配體GLA插入脂質(zhì)雙層，發(fā)現(xiàn)與只含有一種TLR激動劑相比，在脂質(zhì)中組合兩種激動劑更易引發(fā)TH1型免疫且穩(wěn)定期提升至一年以上。

4 非載體佐劑的復(fù)合化

4.1TLR7/8配體(3M-052)+TLR9配體(CpG ODN) TLR7/8激動劑3M-052和TLR9激動劑CpG ODN都可觸發(fā)天然免疫反應(yīng)，繼而誘發(fā)腫瘤特異性免疫[32,33]。之前的研究表明這些激動劑單獨(dú)使用可以提高小腫瘤患者的存活率但對大/晚期腫瘤的治療效果有限。Zhao等[34]使實(shí)驗(yàn)鼠荷同種基因腫瘤，在腫瘤達(dá)到500～800 mm3之后，分別在瘤內(nèi)注射3M-052、CpG ODN和CpG ODN+3M-052，并對抗腫瘤免疫和腫瘤生長進(jìn)行了評價(jià)。發(fā)現(xiàn)聯(lián)合使用時(shí)導(dǎo)致腫瘤浸潤C(jī)TL和NK細(xì)胞的募集增加，減少髓系抑制性細(xì)胞(Myeloid-derived suppressor cell，MDSC)的數(shù)量，并顯著減小腫瘤體積，同時(shí)提供長期保護(hù)防止腫瘤再生。

4.2TLR9配體(CpG ODN)+TLR3配體[poly(I∶C)] Whitmore等[35]最早驗(yàn)證了poly(I∶C)與CpG ODN合用可以增強(qiáng)對天然免疫細(xì)胞的刺激；通過誘導(dǎo)一氧化氮的產(chǎn)生及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、IL-1β、IL-6、IL-8和巨噬細(xì)胞炎癥蛋白的表達(dá)，在雞單核細(xì)胞中誘導(dǎo)比單獨(dú)使用poly(I∶C)或CpG ODN時(shí)更強(qiáng)烈且持續(xù)時(shí)間更長的促炎反應(yīng)[36]。將poly(I∶C) 與CpG ODN聯(lián)合用于癌癥治療時(shí)，應(yīng)交替而非同時(shí)使用，因?yàn)镃pG的硫代磷酸酯修飾作用會阻斷poly(I∶C)進(jìn)入腫瘤細(xì)胞[37]。混合佐劑CpG ODN+poly(I∶C)增強(qiáng)了東部馬腦炎病毒DNA疫苗的免疫原性，并在接種的小鼠中顯著增強(qiáng)IL-2、IL-4和IFN-γ高水平分泌的CD4+T細(xì)胞應(yīng)答，也增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞對IL-2和IFN-γ的反應(yīng)[38]。

4.3TLR4配體(MPL)+ T細(xì)胞共刺激分子(Streptavidin-4-IBB ligand，SA-4-1BBL) 基于腫瘤相關(guān)抗原的疫苗由于其免疫原性弱以及在晚期腫瘤中各種活躍的免疫逃避機(jī)制，其治療效果有限。Srivastava等[39]聯(lián)合應(yīng)用兩種不同類型的佐劑SA-4-1BBL和MPL，將它們不同的免疫細(xì)胞靶點(diǎn)、信號通路以及活化細(xì)胞免疫反應(yīng)的作用相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)在無毒性的情況下，疫苗在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭锌筛[瘤。SA-4-1BBL/MPL佐劑組合的效應(yīng)與活化樹突狀細(xì)胞(Dendritic cell，DC)、增加CD8+T細(xì)胞在腫瘤中的浸潤、顯著減少CD4+CD25+Foxp3+T調(diào)節(jié)細(xì)胞有關(guān)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，組合佐劑中的MPL與DC上的TLR4結(jié)合使其活化，上調(diào)共刺激受體/配體和各種促炎因子如IL-12、IL-16和IFN-γ，從而啟動適應(yīng)性T細(xì)胞免疫應(yīng)答。SA-4-1BBL通過與DC上的受體結(jié)合活化DC、克服T調(diào)節(jié)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫抑制來增強(qiáng)MPL的作用，與CD8+T細(xì)胞上的受體結(jié)合可使其增殖、分化、轉(zhuǎn)化為致敏T細(xì)胞，并建立長期記憶[40]。

5 展望

佐劑的復(fù)合化可以在提高抗原免疫原性、免疫應(yīng)答強(qiáng)度、免疫記憶以及減少免疫耐受等方面發(fā)揮更好的效果，同時(shí)利于控制副作用。尤其腫瘤疫苗的發(fā)展面臨著兩大障礙：免疫抑制和抗原性差，復(fù)合佐劑應(yīng)用于腫瘤疫苗是最有希望規(guī)避這些障礙的方法[41]。新型佐劑組合可以通過激活多種免疫細(xì)胞和免疫機(jī)制，產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)來增強(qiáng)免疫應(yīng)答。