宋 蓓, 王 菲, 李玉澤, 張化為, 黃文麗, 李 翠, 宋小妹*, 劉建利
(1. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院, 陜西 咸陽712046; 2. 西北大學(xué)生命科學(xué)院, 陜西 西安710069;3. 陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院, 陜西 西安710065; 4. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院, 陜西 咸陽712046)
鐵牛七又名鐵棒錘, 為毛茛科烏頭屬植物鐵棒錘Aconitum szechenyianum Gay. 和伏毛鐵棒錘Aconitum flavum Hand. Mazz. 的干燥塊根。 其藥性味苦、 辛, 性溫, 有大毒。 有活血祛瘀、 祛風(fēng)除濕、止痛消腫等功效。 主治跌打損傷、 風(fēng)濕、 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、 牙痛、 腹痛、 毒蛇咬傷等[1]。 二萜類生物堿是鐵牛七中主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ), 是一類化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜、 生物活性較強的植物特異性成分[2-6]。 這類成分多具有抗炎、 鎮(zhèn)痛、 抗癌、 抗癲癇以及抗寄生蟲等作用[7-9]。 目前, 從鐵牛七中共分離出22 個二萜生物堿; 伏毛鐵棒錘中共分離得到26 個二萜生物堿, 非生物堿6 個, 最近研究表明鐵牛七活性成分顯示出一定的抗炎和免疫抑制作用[10-11]。 本實驗從中分離得到7 個化合物, 其中化合物1 ~4 首次從該植物中分離得到。
Bruker-AVANCE400 型核磁共振儀(TMS 為內(nèi)標(biāo), 德國Bruker 公司); Waters e2695 高效液相色譜儀(美國Waters 公司); ZF-1 型三用紫外線分析儀(上海金鵬分析儀器有限公司); 柱層析硅膠(青島海洋有限公司); Sephadex LH-20 (美國Ge公司); LC-6AD 型半制備液相色譜儀(紫外可見光檢測器SPD-20A, 日本Shimadzu 公司); YMCPack-ODS-A 半 制 備 色 譜 柱 (10 mm × 250 mm,5 μm); 預(yù)制硅膠板GF254(青島海洋化工廠);OB204 電子分析天平(萬分之一, 瑞士Mettler-Toledo 公司); 超聲波清洗器(KQ5200 型, 昆山市超聲儀器有限公司); HH-2 型恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)。 色譜純甲醇(天津科密歐公司); 娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團)。
藥材于2014 年7 月采自甘肅省西山, 經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室王繼濤高級實驗師鑒定為毛茛科烏頭屬鐵棒錘Aconitum szechenyianum Gay. 的塊根。
鐵棒錘干燥根5.0 kg 粉碎后, 用80%乙醇8 倍量加熱回流提取3 次, 1.5 h/次, 合并濾液, 減壓蒸餾得浸膏。 將浸膏分散于鹽酸水溶液(pH 0.8)中, 用石油醚萃取該水溶液, 萃后水相用氨水調(diào)至pH 10.26, 再用三氯甲烷萃取堿水相得到總生物堿(50 .0 g)。
取總生物堿47 g, 經(jīng)硅膠柱層析石油醚-丙酮-二乙胺(50 ∶1 ∶0.1 ~1 ∶1 ∶0.1) 梯度洗脫, 得到7 個部分(Fr.1 ~Fr.7)。 Fr.3 經(jīng)半制備高效液相(83%甲醇-水) 得到化合物4 (10 mg)。 Fr.6經(jīng)半制備高效液相(70%甲醇-水) 得到6 個部分(Fr.6-1 ~Fr.6-6); Fr.6-3 經(jīng) 半 制 備 高 效 液 相(70%甲醇-水) 得到化合物1 (15 mg)、 2 (10 mg)、 3 (7 mg); Fr.6-6 經(jīng)半制備高效液相(65%甲醇-水) 得到化合物7 (23 mg); Fr.7 經(jīng)半制備高效液相(65%甲醇-水) 得到化合物5 (7 mg)、6 (30 mg)。
化合物1: 白色無定型粉末, C26H43NO9。 碘化鉍鉀反應(yīng)陽性(紅棕色), 表明該化合物可能為生物堿類。1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 3.05(1H, t, J = 6.2 Hz, H-1), 1.86 (1H, m, H-2), 2.32 (1H, m, H-2), 3.76 (1H, dd, J =8.3, 4.6 Hz, H-3), 2.05 (1H, d, J=6.4 Hz,H-5), 4.03 (1H, d, J = 5.9 Hz, H-6), 2.73(1H, brs, H-7), 2.17 (1H, t, J= 6.3 Hz, H-9), 1.86 (1H, m, H-10), 1.96 (1H, m, H-12α), 2.42 (1H, m, H-12β), 3.80 (1H, d,J=5.3 Hz, H-14 β), 4.53 (1H, d, J=5.2 Hz,H-15 β), 3.14 (1H, J = 6.1 Hz, H-16), 2.84(1H, brs, H-17), 3.45 (1H, d, J=8.6 Hz, H-18), 3.61 (1H, d, J = 8.7 Hz, H-18), 2.45( 1H, m, H-19β), 2.84 ( 1H, m, H-19α),1.05 (3H, t, J = 7.1 Hz, N-CH2-CH3), 2.45(1H, m, N-CH2α-CH3), 2.85 (1H, m, N-CH2β-CH3), 3.28 (3H, s, C-1-OCH3), 3.19 (3H,s, C-6-OCH3), 3.37 (3H, s, C-8-OCH3), 3.64(3H, s, C-16-OCH3), 3.30 ( 3H, s, C-18-OCH3);13C-NMR (CDCl3, 100 MHz) δ: 83.9 (C-1), 33.5 (C-2), 71.9 (C-3), 43.2 (C-4),46.0 (C-5), 82.7 (C-6), 42.5 (C-7), 83.2(C-8), 48.2 (C-9), 41.7 (C-10), 50.6 (C-11), 36.9 (C-12), 76.6 (C-13), 78.4 (C-14),77.8 (C-15), 93.2 (C-16), 62.5 (C-17), 77.1(C-18), 49.0 ( C-19), 13.5 ( N-CH2-CH3),47.6 (N-CH2-CH3), 56.0 (1-OCH3), 58.8 (6-OCH3), 50.5 ( 8-OCH3), 61.1 ( 16-OCH3),59.3 (18-OCH3)。 以上數(shù)據(jù)與文獻[12] 一致,故鑒定為8-O-methylaconine。
化合物2: 白色無定型粉末(甲醇), C27H45NO9。碘化鉍鉀反應(yīng)陽性(紅棕色), 表明該化合物可能為生物堿類。1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 3.09(1H, t, J = 6.1 Hz, H-1), 1.97 (1H, m, H-2), 2.30 (1H, m, H-2), 3.82 (1H, m, H-3),2.10 (1H, d, J=6.5 Hz, H-5), 4.05 (1H, d,J= 5.1 Hz, H-6), 2.73 (1H, brs, H-7), 2.22(1H, t, J = 6.9 Hz, H-9), 1.97 (1H, m, H-10), 2.04 (1H, m, H-12α), 2.33 (1H, m, H-12β), 3.84 (1H, d, J=5.0 Hz, H-14β), 4.55(1H, d, J=6.1 Hz, H-15β), 3.15 (1H, J=6.0 Hz, H-16), 2.87 (1H, brs, H-17), 3.42 (1H,d, J=8.6 Hz, H-18), 3.59 (1H, d, J=8.4 Hz,H-18), 2.48 (1H, m, H-19β), 2.72 (1H, m,H-19α), 1.15 (3H, t, J=6.9 Hz, N-CH2-CH3),2.50 (1H, m, N-CH2α -CH3), 2.69 (1H, m,N-CH2β -CH3), 1.09 (3H, t, J = 7.1 Hz, OCH2-CH3), 2.94 (1H, m, O-CH2α -CH3), 3.62(1H, m, O-CH2β -CH3), 3.30 (3H, s, C-1-OCH3), 3.22 (3H, s, C-6-OCH3), 3.66 (3H,s, C-16-OCH3), 3.32 (3H, s, C-18-OCH3);13CNMR (CDCl3, 100 MHz) δ: 83.4 (C-1), 33.4(C-2), 71.7 (C-3), 43.3 (C-4), 45.8 (C-5),82.6 (C-6), 43.4 (C-7), 83.9 (C-8), 49.1(C-9), 41.6 (C-10), 50.7 (C-11), 37.1 (C-12), 76.7 (C-13), 78.7 (C-14), 78.6 (C-15)93.4 (C-16), 62.5 (C-17), 77.0 (C-18), 48.4(C-19 ), 13.4 ( N-CH2-CH3), 47.7 ( N-CH2-CH3), 58.0 (8-O-CH2-CH3), 16.3 (8-O-CH2-CH3), 56.0 (1-OCH3), 59.0 (6-OCH3), 61.4(16-OCH3), 59.3 (18-OCH3)。 以上數(shù)據(jù)與文獻[13] 一致, 故鑒定為8-O-ethylaconine。
化合物3: 白色無定型粉末(甲醇), C33H47NO10。碘化鉍鉀反應(yīng)陽性(紅棕色), 表明該化合物可能為生物堿類。1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 3.22(1H, d, J = 6.4 Hz, H-1), 3.91 (1H, m, H-3), 2.31 (1H, m, H-5), 4.09 (1H, d, J=6.7 Hz, H-6β), 2.78 (1H, brs, H-7), 2.65 (1H,t, J = 6.1 Hz, H-9), 2.31 (1H, m, H- 10),2.13 ( 1H, m, H-12α ), 2.88 ( 1H, m, H-12β), 4.81 (1H, d, J=5.1 Hz, H -14β), 4.54(1H, d, J=5.8 Hz, H-15β), 3.23 (1H, d, J=5.0 Hz, H-16), 2.97 (1H, s, H-17), 3.56(1H, d, J=8.7 Hz, H-18β), 3.48 (1H, d, J=8.9 Hz, H-18α), 2.57 (3H, s, N-CH3), 0.56(3H, t, J = 6.9 Hz, O-CH2-CH3), 3.20 (1H,m, O-CH2α -CH3), 3.51 ( 1H, m, O-CH2β-CH3), 3.30 (3H, s, C-1-OCH3), 3.26 (3H, s,C-6-OCH3), 3.74 (3H, s, C-16-OCH3), 3.31(3H, s, C-18-OCH3), 8.02 (2H, d, J=7.5 Hz,H-2′, 6′), 7.54 (1H, t, J = 7.2 Hz, H-4′),7.43 (2H, t, J = 7.8 Hz, H-3′, 5′);13C-NMR(CDCl3, 100 MHz) δ: 82.4 (C-1), 32.9 (C-2),71.1 (C-3), 43.8 (C-4), 45.1 (C-5), 83.2(C-6), 44.5 (C-7), 82.1 (C-8), 42.6 (C-9),41.3 (C-10), 51.0 (C-11), 36.2 (C-12), 74.9(C-13), 79.5 (C-14), 78.4 (C-15), 93.3 (C-16), 62.4 (C-17), 76.7 (C-18), 50.5 (C-19),57.5 ( 8-O-CH2-CH3), 15.5 ( 8-O-CH2-CH3),42.8 ( N-CH3), 56.4 ( 1-OCH3), 58.9 ( 6-OCH3), 64.0 ( 16-OCH3), 59.4 ( 18-OCH3),166.5 (Ar-CO), 128.5 (C-1′), 129.9 (C-2′,6′), 128.6 (C-3′, 5′), 133.2 (C-4′)。 以上數(shù)據(jù)與文獻 [14] 一致, 故鑒定為8-O-ethyl-14-benzoylmesaconine。
化合物4: 白色無定型粉末(甲醇), C32H45NO10。碘化鉍鉀反應(yīng)陽性(紅棕色), 表明該化合物可能為生物堿類。1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 3.12(1H, d, J = 5.6 Hz, H-1), 4.20 (1H, m, H-3), 2.24 (1H, m, H-5), 4.20 (1H, d, J=5.5 Hz, H-6), 2.86 (1H, s, H-7), 2.54 (1H, t,J=6.3 Hz, H-9), 2.14 (1H, m, H-10), 4.92(1H, d, J=5.1 Hz, H-14β), 4.75 (1H, d, J=5.6 Hz, H-15β), 3.28 (1H, m, H-16), 2.88(1H, brs, H-17), 3.45 (1H, d, J=8.3 Hz, H-18β), 3.56 (1H, d, J= 8.3 Hz, H-18α), 1.32(3H, t, J=7.3 Hz, N-CH2-CH3), 3.31 (3H, s,C-1-OCH3), 3.24 ( 3H, s, C-6-OCH3), 3.70(3H, s, C-16-OCH3), 3.35 ( 3H, s, C-18-OCH3), 8.02 (2H, d, J = 7.2 Hz, H-2′, 6′),7.51 (1H, t, J=7.4 Hz, H-4′), 7.43 (2H, t,J = 7.8 Hz, H-3′, 5′);13C-NMR (CDCl3, 100 MHz) δ: 81.3 (C-1), 29.9 (C-2), 70.1 (C-3), 42.6 (C-4), 43.9 (C-5), 81.5 (C-6),43.5 (C-7), 80.3 (C-8), 43.8 (C-9), 40.8(C-10), 50.2 (C-11), 35.6 (C-12), 74.5 (C-13), 78.5 (C-14), 79.0 (C-15), 90.4 (C-16),64.6 (C-17), 77.4 (C-18), 50.2 (C-19), 11.7( N-CH2-CH3), 48.2 ( N-CH2-CH3), 55.5 (1-OCH3), 58.6 ( 6-OCH3), 61.1 ( 16-OCH3),59.4 (18-OCH3), 166.6 (Ar-CO), 130.1 (C-1′), 130.2 ( C-2′, 6′), 128.7 ( C-3′, 5′),133.2 (C-4′)。 以上數(shù)據(jù)與文獻[15] 一致, 故鑒定為苯甲酰烏頭原堿。
化合物5: 白色無定形粉末。 C32H45NO10。 碘化鉍鉀反應(yīng)陽性(紅棕色), 表明該化合物可能為生物堿類。1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 2.99(3H, d, J=4.9 Hz), δ 6.22 (1H, s, N-H); δ 7.75 (2H, d, J = 7.1 Hz, H-2′/H-6′), 7.45(1H, t, J=7.3 Hz, H-4′), 7.40 (2H, t, J=7.7 Hz, H-3′/H-5′);13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ:27.0 (N-CH3), δ 168.5 (-C=O), δ 127.0 (C-3′,5′), 128.8 ( C-2′, 6′), 131.6 ( C-1′), 134.9(C-4′)。 以上數(shù)據(jù)與文獻[16] 一致, 故鑒定為N-甲基苯甲酰胺。
化合物6: 白色針狀結(jié)晶(CH3OH), 易溶于乙醚、 三氯甲烷、 難溶于水, Liebermann-Burchard反應(yīng)呈陽性。 通過與β-谷甾醇對照品共TLC, 經(jīng)3種不同溶劑系統(tǒng)(石油醚-乙酸乙酯、 石油醚-丙酮、 二氯甲烷-丙酮) 展開, 其Rf值均一致, 故鑒定為β-谷甾醇。
化合物7: 白色粉末, 通過與棕櫚酸對照品共TLC, 經(jīng)3 種不同溶劑系統(tǒng)展開, 其Rf值均一致,且混合熔點不下降, 故鑒定為棕櫚酸。
前期研究表明鐵牛七中富含生物堿。 本研究從鐵牛七中共分離得到5 個生物堿, 再次證明了鐵牛七中主要化學(xué)成分為生物堿。 Hiroshi 等[17-18]研究表明, 苯甲酰烏頭原堿減少醋酸所致小鼠扭體次數(shù), 具有一定的鎮(zhèn)痛作用, 而在高劑量時對急性滲出性炎癥有較強的抑制作用, 為研究新的抗炎鎮(zhèn)痛中藥新劑型提供依據(jù)。 Jin-jun Wu[19]研究了苯甲酰烏頭原堿對于多藥耐藥相關(guān)蛋白2 (MRP2) 和乳腺癌抗藥性蛋白(BCRP) 的作用, 結(jié)果表明其顯著增加了MRP2 和BCRP 的表達, 確定了其藥動學(xué)行為, 對烏頭屬植物的安全臨床應(yīng)用具有重要意義。 而關(guān)于這5 個生物堿的活性及其作用機制研究仍然較少, 因此有待進一步研究。