王莉，賀濤，馮世杰，萬百順，王效謙，張珉，張玲，韓風

(鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院/河南省腫瘤醫(yī)院，鄭州450008)

甲胎蛋白(Alpha fetoprotein，AFP)可影響細胞的分化、增殖及腫瘤發(fā)生，目前已被公認為是一種有助于診斷和判斷原發(fā)性肝癌預后的腫瘤標志物，70%的肝癌患者血清高表達AFP[1，2]。肝癌細胞系EGHC-9901是近些年構建的細胞系，可形成完整毛細膽管且有明顯微絨毛，能持續(xù)高分泌AFP，細胞變異較小，是體外研究AFP功能的良好生物學模型[3]。我們在前期研究中利用能持續(xù)高分泌AFP的肝癌細胞系EGHC-9901建立了穩(wěn)定表達siRNA的細胞模型，探討了沉默AFP基因對其生長凋亡的影響及相關機制[4，5]。2017年4月1日～2018年5月30日，我們觀察了AFP基因沉默對肝癌細胞遷移黏附能力的影響，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑及儀器 肝癌細胞系EGHC-9901(前期實驗[4，5]中，我們采用脂質體法已獲得穩(wěn)定轉染的EGHC-9901細胞，Western blotting法及RT-PCR法檢測AFP蛋白及基因確證轉染成功)由山東大學提供。G418、RT-PCR試劑盒、TRIzol、DMEM培養(yǎng)液干粉及胎牛血清購自上海英駿生物技術有限公司，AFP小鼠抗人單克隆抗體及E-鈣黏蛋白、CD44V6、CD15等黏附轉移相關分子抗體購自BD公司(英國)。核酸及蛋白電泳儀、蛋白轉印儀購自BIO-RAD公司(美國)，臺式冷凍離心機購自Sigma公司(美國)，PE2400型 PCR儀購自PE公司(美國)，凝膠圖像分析系統(tǒng)購自UVP公司(美國)，CO2培養(yǎng)箱購自NACPO公司(美國)。

1.2 細胞培養(yǎng)、分組及AFP基因沉默 pSilencer3.0-H1-AFP重組質粒(用于沉默AFP基因)的構建參照文獻[6]，DNA瓊脂糖凝膠電泳及Ml3的通用引物測序表明，該質粒大小與陽性質控質粒相同，插入片段的序列與已合成的寡核苷酸的序列完全一致，未發(fā)現有插入、缺失及突變等異常。EGHC-9901細胞在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液(添加相應的青霉素-鏈霉素等)中，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2的比例傳代。取生長良好的對數生長期EGHC-9901細胞進行試驗。將EGHC-9901細胞分為3組：實驗組轉染pSilencer3.0-H1-AFP質粒、載體對照組轉染空載體、空白對照組未做任何處理。

1.3 各組細胞遷移能力檢測 采用Transwell 遷移實驗。Transwell小室置入24孔培養(yǎng)板,形成上下兩個小室。各組細胞經胰蛋白酶消化后重懸于無血清0.5% BSA DMEM培養(yǎng)基，配制濃度為1×106/mL的細胞懸液,取100 μL細胞懸液加入上層小室,下層小室加胎牛血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后,以甲醇固定Transwell膜，結晶紫染色。洗脫膜表面的細胞并用中性樹膠封閉于玻片中，鏡下觀察穿膜細胞并拍照，隨機選取5～8個視野計數穿膜細胞，取平均值。

1.4 各組細胞同質黏附能力檢測 采用細胞聚集實驗。各組細胞經HCMF洗滌及胰蛋白酶消化后，調節(jié)細胞濃度為2×105/mL，按每孔500 μL細胞懸液加入到BSA包被好的24孔培養(yǎng)板，將培養(yǎng)板置于空氣振蕩器上，80 rpm分別振搖20 min、40 min、60 min，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，并統(tǒng)計聚集細胞數及單個細胞數。通過計算細胞聚集指數(aggregation index，AI)來衡量細胞同質黏附能力。AI=(N0-Nt)/N0，其中N0為細胞聚集實驗開始前總細胞數(包括單個細胞與聚集細胞)，Nt為特定時間后總細胞數(包括單個細胞與聚集細胞)。

1.5 各組細胞異質黏附能力檢測 采用層黏連蛋白黏附實驗。各組細胞經0.1%膠原酶溶液消化，制備細胞懸液，加入到層黏連蛋白包被的96孔培養(yǎng)板，每孔加l×106個細胞，設PBS孔作空白對照組，每組設5個復孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于30 min、60 min、90 min時提取細胞，CCK-8試劑盒避光染色2 h，490 nm處檢測各組OD值，以OD值反映細胞異質黏附能力。

1.6 各組細胞黏附分子E-鈣黏蛋白、CD44V6、整合素β1、整合素α5、α-連環(huán)素、β-連環(huán)素、CD15表達檢測 采用Western blotting法。各組細胞采用改良lorry法進行蛋白定量，繪制標準蛋白濃度曲線，依此作為回歸方程計算待測樣品濃度。經β-巰基乙醇加熱處理后上樣， 5%濃縮膠電泳40～60 min。在PVDF膜進行電轉移，5%脫脂奶粉封閉，敷封閉液稀釋的細胞黏附蛋白AFP小鼠抗人一抗，4 ℃過夜，PBST洗膜，敷封閉液稀釋HRP標記的二抗，室溫靜置4 h，增強化學發(fā)光試劑盒(ECL)檢測黏附蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內參，結果以受檢蛋白灰度值/GAPDH灰度值表示。

2 結果

2.1 各組細胞遷移能力比較 實驗組、載體對照組、空白對照組每個鏡下穿膜細胞數分別為(132±16)個、(335±21)個、(371±32)個，實驗組與載體對照組、空白對照組相比，P<0.05。

2.2 各組細胞同質黏附能力比較 實驗組鏡下可見大量的細胞團塊狀組織，而載體對照組及空白對照組可見大量散在的細胞及小的細胞團塊。

振搖時間20 min時，實驗組、載體對照組、空白對照組AI分別為0.263±0.010、0.216±0.013、0.220±0.009，組間相比，P均>0.05。振搖時間40 min時，實驗組、載體對照組、空白對照組AI分別為0.530±0.020、0.223±0.017、0.240±0.012，實驗組與載體對照組、空白對照組相比，P均<0.05。振搖時間60 min時，實驗組、載體對照組、空白對照組AI分別為0.632±0.031、0.322±0.021、0.376±0.019，實驗組與載體對照組、空白對照組相比，P均<0.05。

2.3 各組細胞異質黏附能力比較 培養(yǎng)30 min時，實驗組、載體對照組、空白對照組OD值分別為0.225±0.014、0.223±0.018、0.267±0.020，組間相比，P均>0.05。培養(yǎng)60 min時，實驗組、載體對照組、空白對照組OD值分別為0.157±0.008、0.347±0.026、0.363±0.039，實驗組與載體對照組、空白對照組相比，P均<0.05。培養(yǎng)90 min時，實驗組、載體對照組、空白對照組OD值分別為0.139±0.010、0.476±0.023、0.503±0.045，實驗組與載體對照組、空白對照組相比，P均<0.05。

2.4 各組細胞黏附分子E-鈣黏蛋白、CD44V6、整合素β1、整合素α5、α-連環(huán)素、β-連環(huán)素、CD15表達比較 見表1。

表1 各組細胞黏附分子E-鈣黏蛋白、CD44V6、整合素β1、整合素α5、α-連環(huán)素、β-連環(huán)素、CD15表達比較

注：與空白對照組相比，﹡P<0.05；與載體對照組相比，﹟P<0.05。

3 討論

腫瘤細胞的遷移是一個多步驟、多階段的復雜過程， 其中腫瘤細胞與細胞外基質和基底膜黏附、腫瘤細胞侵襲細胞外基質和血管基膜、腫瘤細胞向遠處遷移是轉移過程中的三個重要步驟，包括蛋白降解酶、腫瘤細胞的侵襲遷移以及腫瘤細胞的黏附[7]。細胞合適的遷移黏附是機體維持正常的生命活動與防御機制所必須的，但遷移黏附能力的異常改變是導致腫瘤侵襲轉移的重要因素[8]。腫瘤細胞自身黏附能力，即同質黏附能力的減弱將會導致腫瘤的播散；腫瘤細胞與基質等黏附能力，即異質黏附能力的增強則會導致腫瘤的轉移[9]。在本實驗中，我們檢測了轉染前后細胞遷移能力、同質黏附能力以及異質黏附能力的變化，結果發(fā)現，AFP基因沉默可抑制肝癌細胞遷移，促進肝癌的同質黏附能力，抑制細胞異質黏附能力。

黏附能力的改變主要由細胞黏附分子介導[10]。細胞黏附分子本質上是細胞膜上的一類跨膜糖蛋白，能夠介導腫瘤細胞與細胞外基質、血管內皮細胞及實質器官組織細胞或其它腫瘤細胞之間的相互作用，包括免疫球蛋白超家族、 整合素家族、 選擇素家族和血管附著素家族黏附分子以及鈣黏素家族等。與原發(fā)性肝癌的侵襲轉移相關的主要黏附分子包括E-鈣黏蛋白、CD44V6、整合素β1、整合素α5、α-連環(huán)素、β-連環(huán)素、CD15等[11]。E-鈣黏蛋白與肝癌的分化程度、侵襲轉移能力以及病情發(fā)展密切相關[12];E-鈣黏蛋白的低表達或缺失往往提示肝癌侵襲能力強，分化程度低，且容易經淋巴結或血液轉移[13]。CD44V6是一種細胞表面黏附分子，主要參與細胞與細胞、細胞與細胞外基質的特異性黏連，參與細胞偽足的形成，引起細胞的形態(tài)和游動性改變，直接參與腫瘤的侵襲和轉移；CD44V6在正常肝臟組織或良性肝臟腫瘤往往低表達，而在肝臟惡性腫瘤中則往往高表達，并且表達的高低與腫瘤的侵襲轉移能力呈正相關[14]。整合素家族是一組介導細胞與細胞以及細胞與基質之間的跨膜糖蛋白，參與跨膜信息系統(tǒng)，影響細胞形態(tài)、基因表達與調控以及腫瘤侵襲轉移等[15]。β-連環(huán)素是一種重要的信號轉導分子和細胞間黏附分子,是Wnt信號轉導通路的關鍵調控點，并是構成黏附連接的E-cd/cat復合體的胞內重要成分,并通過與多種蛋白的結合參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、增殖分化、侵襲轉移等生物學過程[16]。CD15 是細胞表面糖蛋白或糖脂含有的外鏈巖藻糖化的乙酰乳糖胺糖鏈，作為細胞黏附分子成員，可通過結合含有選凝素的血小板、粒細胞及內皮細胞促進癌細胞轉移，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[17]。本研究檢測了轉染前后E-鈣黏蛋白、CD44V6、CD15等黏附轉移相關分子表達水平變化，結果發(fā)現，整合素β1蛋白表達量升高、CD15蛋白表達量降低，提示AFP可能通過調節(jié)黏附蛋白整合素β1、CD15的表達調控肝癌細胞的遷移黏附能力。

綜上，AFP基因沉默表達可抑制肝癌細胞遷移，促進肝癌的同質黏附能力，抑制細胞異質黏附能力。AFP可能通過調節(jié)黏附分子整合素β1、CD15的表達調控肝癌細胞的遷移黏附能力。