凌芳，沈慧玲

(1 江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇鎮(zhèn)江212001；2 江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院)

宮頸癌是威脅女性生命健康的重大疾病，據(jù)統(tǒng)計，全球每年約有53萬新發(fā)病例[1]。近年來，宮頸癌在手術(shù)、放化療等方面取得了較好的臨床療效，但仍有超過半數(shù)的宮頸癌患者處于疾病晚期，放化療耐藥是制約臨床療效、導(dǎo)致宮頸癌晚期患者不良預(yù)后的重要原因。腫瘤組織中存在能夠自我更新并分化為腫瘤細胞的腫瘤干細胞,與其他腫瘤干細胞類似，宮頸癌干細胞對放化療具有原發(fā)耐藥性，是導(dǎo)致宮頸癌化療耐藥、術(shù)后復(fù)發(fā)的主要原因[2]。乙醛脫氫酶1A1(ALDH1A1)是新近發(fā)現(xiàn)的腫瘤干細胞標志分子，與多種實體腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]。越來越多的證據(jù)表明，微小RNA(microRNAs)異常表達在疾病或腫瘤的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，如microRNA-187(miR-187)通過抑制FGF9基因表達進而抑制宮頸癌細胞增殖[4]，miR-494參與調(diào)節(jié)SOCS6基因表達，調(diào)控宮頸癌細胞增殖過程[5]。有報道[6]稱，在宮頸癌中，miR-23b具有抑癌基因功能，而關(guān)于miR-23b在宮頸癌干細胞中的表達及作用機制，鮮見文獻報道。2015年7月～2018年2月，本研究觀察了miR-23b轉(zhuǎn)染對宮頸癌干細胞順鉑(CDDP)化療敏感性的影響，并探究其作用機制。

1 材料與方法

1.1 miR-23b、細胞及試劑 miR-23b模擬物(miR-23b mimics)、miR-23b陰性對照物(miR-23b NC)由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。人宮頸癌細胞系CaSki和人胚胎腎細胞系HEK-293T均購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶和DMSO試劑均購于美國Invitrogen生命技術(shù)有限公司，CD133抗體(ab19898)購于美國Abcam公司，RNA提取試劑盒、real-time PCR試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司，定量引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成，順鉑(CDDP，國藥準字H37021358)購于山東齊魯制藥有限公司，CCK-8試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司，Lipofectamine?3000脂質(zhì)體試劑盒購自美國Invitrogen公司，RIPA裂解液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。兔抗人ALDH1A1單抗體、兔抗人GAPDH多克隆抗體購于美國Abcam公司，HRP標記二抗、ECL發(fā)光液購自北京諾特萊斯生物科技有限公司。內(nèi)參質(zhì)粒SV40、pmirGLO-ALDH1A1-3′-UTR wt(野生型)熒光素酶質(zhì)粒、pmirGLO-ALDH1A1-3′-UTR mut(突變型)熒光素酶質(zhì)粒和pmirGLO空載體質(zhì)粒由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，雙熒光素酶檢測試劑盒購于北京威格拉斯生物技術(shù)有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)和宮頸癌干細胞(CDl33+CaSki細胞)的分選[7]人宮頸癌CaSki細胞和HEK-293T細胞均培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基(含10% 胎牛血清)，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中，采用0.25%胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)，DMSO試劑進行細胞凍存，遵循緩凍速融原則，維持細胞狀態(tài)良好。取處于對數(shù)生長期的CaSki細胞，胰蛋白酶消化后，用PBS緩沖液調(diào)整細胞濃度為1×106/mL，加入CD133抗體，避光孵育20 min，流式細胞儀進行分選。采用流式細胞術(shù)檢測CD133+CaSki細胞比例，分選前后CaSki細胞中CD133+CaSki細胞占比分別為3.02%±0.63%和95.88%±5.35%，提示分選成功。

1.3 CaSki細胞中miR-23b的檢測及其靶基因預(yù)測 TRIzol法分別提取CD133+CaSki細胞和宮頸癌非干細胞(CD133-CaSki細胞)總RNA，測定濃度及純度后，取1 μg RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA，產(chǎn)物置于-80 ℃保存。參照real-time PCR試劑盒的反應(yīng)條件和反應(yīng)體系進行PCR擴增，引物序列如下：miR-23b正向引物為5′-TGTTAGCTGATGCCGACTTG-3′， miR-23b反向引物為5′-TTC TTAGCCCGCTCAACACT-3′；內(nèi)參β-Actin正向引物為5′-GCTATCCTGTACGCCTCTG-3′，內(nèi)參β-Actin反向引物為5′-ACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3′。miR-23b相對表達量以2-ΔΔCt表示。采用TargetScan和PITA等miRNA靶基因預(yù)測分析數(shù)據(jù)庫，預(yù)測miR-23b的靶基因。

1.4 miR-23b的轉(zhuǎn)染及CDDP對CD133+CaSki細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)檢測 將CD133+CaSki細胞按6×103個/孔的密度接種于96孔板，孵育過夜，嚴格參照Lipofectamine?3000脂質(zhì)體試劑盒說明書進行操作。將CD133+CaSki細胞分為mimics組、NC組、空白對照組，mimics組轉(zhuǎn)染miR-23b mimics，NC組轉(zhuǎn)染miR-23b NC，空白對照組不做任何處理。轉(zhuǎn)染6 h之后,無血清DMEM培養(yǎng)液稀釋CDDP至不同濃度(0、1、2、4、8、16、32 μg/mL)后加入各組，藥物處理48 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，每組設(shè)置3個復(fù)孔，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，450 nm波長下測定OD值，計算CDDP對各組細胞的IC50。

1.5 CD133+CaSki、CD133-CaSki、轉(zhuǎn)染miR-23b mimics的CD133+CaSki細胞中ALDH1A1蛋白檢測 采用Western blotting法。RIPA裂解液分別提取CD133+CaSki細胞、CD133-CaSki細胞和轉(zhuǎn)染miR-23b mimics的CD133+CaSki細胞總蛋白，SDS-PAGE膠分離蛋白后，轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜，封閉緩沖液室溫孵育1 h后，分別加入ALDH1A1和GAPDH一抗，室溫孵育1 h，PBST緩沖液洗滌3次后分別加入HRP標記的二抗，室溫孵育1 h，PBST緩沖液洗滌3次后ECL發(fā)光液顯色，進行灰度分析，計算ALDH1A1蛋白相對表達量。ALDH1A1蛋白相對表達量=(ALDH1A1蛋白灰度值/GAPDH蛋白灰度值)×100%。

1.6 HEK-293T細胞miR-23b mimics、野生型和突變型pmirGLO-ALDH1A1-3′-UTR的轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染質(zhì)粒編碼蛋白的熒光強度檢測 將HEK-293T細胞按5×106個/孔的密度接種于6孔板中，孵育過夜。將HEK-293T細胞分為wt 組、mut組、空載體組，每組設(shè)置3個復(fù)孔，wt 組轉(zhuǎn)染miR-23b mimics、內(nèi)參質(zhì)粒SV40、pmirGLO-ALDH1A1-3′-UTR wt(野生型)熒光素酶質(zhì)粒，mut組轉(zhuǎn)染miR-23b mimics、內(nèi)參質(zhì)粒SV40、pmirGLO-ALDH1A1-3′-UTR mut(突變型)熒光素酶質(zhì)粒，空載體組轉(zhuǎn)染miR-23b mimics、內(nèi)參質(zhì)粒SV40、pmirGLO空載體質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染24 h后，采用雙熒光素酶試驗檢測各組細胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒編碼蛋白的熒光強度，計算各組細胞內(nèi)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒編碼蛋白的相對熒光強度。各組細胞內(nèi)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒編碼蛋白的相對熒光強度=(各組目的轉(zhuǎn)染質(zhì)粒編碼蛋白的熒光強度/內(nèi)參轉(zhuǎn)染質(zhì)粒編碼蛋白的熒光強度)×100%。

2 結(jié)果

2.1 CD133+CaSki、CD133-CaSki細胞中miR-23b的表達比較及miR-23b靶基因預(yù)測結(jié)果 CD133+CaSki、CD133-CaSki細胞中miR-23b的相對表達量分別為0.29±0.05、1.09±0.14，兩者相比，P<0.01。miRNA靶點預(yù)測公共數(shù)據(jù)庫TargetScan的分析結(jié)果顯示，ALDH1A1基因可能是miR-23b的靶基因，見圖1。

圖1 野生與突變ALDH1A1基因3′-UTR與miR-23b序列配對示意圖

2.2 CDDP對各組CD133+CaSki細胞的IC50比較 CDDP對mimics組、NC組、空白對照組細胞的IC50分別為(8.18±1.02)、(13.98±1.48)、(14.15±1.27)μg/mL；mimics組與NC組和空白對照組相比，P均<0.05；NC組與空白對照組相比，P>0.05。

2.3 CD133+CaSki、CD133-CaSki、轉(zhuǎn)染miR-23b mimics的CD133+CaSki細胞中ALDH1A1蛋白表達比較 CD133+CaSki、CD133-CaSki、轉(zhuǎn)染miR-23b mimics的CD133+CaSki細胞中ALDH1A1蛋白相對表達量分別為0.29±0.06、0.12±0.03、0.13±0.04，ALDH1A1蛋白在CD133+CaSki細胞中的相對表達量與CD133-CaSki細胞和轉(zhuǎn)染miR-23b mimics的CD133+CaSki細胞相比，P均<0.05；ALDH1A1蛋白在CD133-CaSki細胞中的相對表達量與轉(zhuǎn)染miR-23b mimics的CD133+CaSki細胞相比，P>0.05。

2.4 HEK-293T細胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒編碼蛋白的相對熒光強度比較 HEK-293T細胞中，wt組、mut組、空載體組轉(zhuǎn)染質(zhì)粒編碼蛋白的相對熒光強度分別為0.41±0.06、1.12±0.15、1.02±0.15。其中，wt 組轉(zhuǎn)染質(zhì)粒編碼蛋白的相對熒光強度與mut組和空載體組相比，P均<0.05；mut組轉(zhuǎn)染質(zhì)粒編碼蛋白的相對熒光強度與空載體組相比，P>0.05。

3 討論

腫瘤干細胞對化療藥物具有原發(fā)耐藥性，在腫瘤化療耐藥中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。近年來的研究[8]證實，microRNAs表達異常與腫瘤干細胞化療耐藥密切相關(guān)，如在惡性膠質(zhì)瘤干細胞中，miR-125b通過靶向Bcl-2和Bak1基因，調(diào)控細胞對化療藥物的敏感性。miR-23b是新近發(fā)現(xiàn)的一種具有抑癌基因功能的microRNAs，在腫瘤的多種生理過程中發(fā)揮作用，如腫瘤生長、血管形成和侵襲轉(zhuǎn)移等[9]，且與多種實體腫瘤的不良預(yù)后密切相關(guān)[10]。此外，miR-23b在維持腫瘤干細胞特性和分化中，也占有重要地位[11, 12]。本研究采用流式細胞術(shù)成功分選出宮頸癌干細胞CD133+CaSki，發(fā)現(xiàn)在CD133+CaSki細胞中miR-23b表達水平降低，且CDDP對CD133+CaSki細胞IC50升高，由此推測miR-23b低表達可能導(dǎo)致了CD133+CaSki細胞對CDDP產(chǎn)生耐藥性。緊接著，我們將CD133+CaSki細胞轉(zhuǎn)染miR-23b后，IC50降低，提示miR-23b表達增加能夠部分逆轉(zhuǎn)細胞對CDDP的耐藥性。

microRNAs能夠與靶基因信使RNA 3′-UTR特異性結(jié)合，導(dǎo)致翻譯抑制或者信使RNA降解。此外，研究[13]發(fā)現(xiàn)，microRNAs可影響基因啟動子區(qū)的CpG島甲基化作用，在轉(zhuǎn)錄水平直接對靶基因進行調(diào)控。本研究借助于TargetScan數(shù)據(jù)庫，推測miR-23b的潛在靶基因，并對靶基因功能進行初步篩選，選擇其中與腫瘤細胞化療耐藥相關(guān)的基因進行驗證。

藥物代謝酶可通過對化療藥物進行代謝解毒，進而影響細胞的化療敏感性。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多個microRNAs通過調(diào)節(jié)藥物代謝酶基因表達，參與腫瘤干細胞的化療耐藥，如miR-24可與二氫葉酸還原酶(DHFR)信使mRNA 3′-UTR結(jié)合，抑制DHFR基因表達，而當DHFR信使RNA 3′-UTR發(fā)生自發(fā)突變時，miR-24無法與之結(jié)合，引起DHFR基因過表達，進而導(dǎo)致腫瘤干細胞對甲氨蝶呤產(chǎn)生耐藥性[14]。乙醛脫氫酶(ALDHs)是一類NA(D)P+依賴酶，ALDH1A1是ALDHs超家族成員之一。ALDH1A1能夠催化醛類物質(zhì)氧化為羧基，在正常干細胞及腫瘤干細胞中均高表達，參與細胞的自我保護、增殖和分化等[15]。本研究結(jié)果顯示，ALDH1A1蛋白在CD133+CaSki細胞中表達增加，而CD133+CaSki細胞對CDDP具有耐藥性，提示ALDH1A1可能與CD133+CaSki細胞化療耐藥有關(guān)。

有研究[16]證實，ALDH1可促進環(huán)磷酰胺、CDDP等化療藥物代謝，降低其細胞毒性，導(dǎo)致腫瘤細胞的化療耐藥。本研究選擇常用于表達外源基因且容易轉(zhuǎn)染的HEK-293T細胞，檢測miR-23b與ALDH1A1 3′-UTR的結(jié)合情況，結(jié)果證實miR-23b能夠與ALDH1A1 3′-UTR結(jié)合，抑制ALDH1A1基因表達，由此，我們推測在CD133+CaSki細胞中，miR-23b低表達引起ALDH1A1基因表達增加，進而導(dǎo)致細胞對CDDP產(chǎn)生耐藥，這可能是miR-23b介導(dǎo)CD133+CaSki細胞化療耐藥的內(nèi)在機制之一。

綜上所述，在宮頸癌干細胞中，miR-23b通過抑制ALDH1A1基因表達，增強CDDP化療敏感性。miR-23b具有作為宮頸癌治療靶分子的潛能。