劉佳，馬冬，滑娜，郭穎，樊少蓓，張夢，陳允恩，耿彤瑤，李秀福，王海秋，李鷗

(1 華北理工大學(xué)，河北唐山063000；2 河北省出入境檢驗檢疫局；3 唐山市工人醫(yī)院)

宮頸癌是導(dǎo)致全世界婦女癌癥相關(guān)死亡的第四大原因[1]。高危型人乳頭瘤病毒的持續(xù)性感染可誘發(fā)宮頸慢性炎癥反應(yīng)[2]。嗜中性粒細(xì)胞作為免疫細(xì)胞的一種，占體循環(huán)白細(xì)胞總數(shù)的50%～70%，是機(jī)體感染或炎癥產(chǎn)生的第一道防線[3, 4]，其浸潤在腫瘤微環(huán)境中則被稱為腫瘤浸潤性中性粒細(xì)胞(tumor-infiltrating neutrophils，TINs)，參與腫瘤的血管生成、免疫調(diào)節(jié)、生長轉(zhuǎn)移等生物學(xué)功能。TINs分為N1型(抑瘤)和N2型(促瘤)兩型[5]，可產(chǎn)生或趨化多種組織降解酶類、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、細(xì)胞因子和趨化因子參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4]。在多種惡性腫瘤患者中如肝癌、膽管癌及宮頸癌等，均有TINs的浸潤，且與腫瘤不良預(yù)后相關(guān)[6～8]；潰瘍性結(jié)腸炎組織中浸潤的TINs可促進(jìn)其發(fā)展成結(jié)腸癌[9]。但TINs在宮頸病變組織中的浸潤情況目前尚未見報道。本研究觀察了TINs在宮頸組織癌變過程中的表達(dá)變化，探討其對免疫細(xì)胞CD8+T、部分腫瘤促進(jìn)因子表達(dá)的影響?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2014年9月～2017年9月在華北理工大學(xué)附屬唐山市工人醫(yī)院接受子宮切除手術(shù)或?qū)m頸組織活檢的患者159例，其中良性子宮疾病患者36例(對照組)、宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)Ⅰ級(CINⅠ)患者47例(CINⅠ組)、CINⅡ/Ⅲ級患者34例(CINⅡ/Ⅲ組)、宮頸鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma of the cervix，SCC)患者42例(SCC組)。嚴(yán)格按照宮頸組織標(biāo)本收集的納入和排除標(biāo)準(zhǔn)收集標(biāo)本，標(biāo)本收集后-80 ℃冰箱保存。宮頸組織標(biāo)本收集納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床資料完整；②病理檢查確診為CINⅠ、CINⅡ/Ⅲ或SCC；③SCC患者術(shù)前未接受化療、放療；④對照組標(biāo)本行宮頸薄層液基細(xì)胞學(xué)檢查未見非典型鱗狀細(xì)胞或癌細(xì)胞。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前3個月內(nèi)曾行宮頸局部治療，如陰道用藥、冷凍或激光治療等；②患者當(dāng)前為妊娠狀態(tài)；③合并有免疫性疾病或其他惡性腫瘤的患者；④本次手術(shù)前合并有急性或慢性感染；⑤合并有血液系統(tǒng)疾病、血栓或出血性疾病。標(biāo)本的獲取均經(jīng)患者知情同意，并由兩位病理醫(yī)師檢查證實診斷。本研究經(jīng)唐山市工人醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 各組宮頸組織中的TINs的測算 每組隨機(jī)取3個組織標(biāo)本，采用特異性酯酶染色法染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組宮頸組織中TINs著色情況，計算TINs細(xì)胞百分比。

1.3 各組宮頸組織中CD66b+TINs(CD66b為TINs表面特異性分子標(biāo)志物[10])及CD8+T細(xì)胞的檢測 將各組宮頸組織標(biāo)本分別用兔抗CD66b抗體(1∶100稀釋)、兔抗CD8抗體(即用型)進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測，由兩位病理醫(yī)師評估CD66b+TINs和CD8+T細(xì)胞的免疫染色情況。高倍(HPF，400×)顯微鏡下觀察、拍照，每張宮頸組織切片取5個視野，用Image-pro Plus軟件分別計算CD66b+TINs細(xì)胞(呈棕黃色)百分比和CD8+T細(xì)胞(呈棕黃色)百分比。根據(jù)CD66b+TINs細(xì)胞百分比平均數(shù)，將SCC組分為CD66b+TINs高表達(dá)組和CD66b+TINs低表達(dá)組。

1.4 SCC組宮頸癌組織中腫瘤促進(jìn)因子組織降解酶類(MMP-9、MMP-3、MMP-1)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、細(xì)胞因子(IL-11、IL-8、IL-18)和趨化因子(CCL2、CCL5、CXCL10)mRNA檢測 采用RT-qPCR法檢測。TRIzol試劑提取宮頸癌組織總RNA，以RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，內(nèi)參基因為GAPDH。目的基因及內(nèi)參基因擴(kuò)增引物序列如下：MMP-9正向引物為5′-AGTGGGCTACGTGACCTATGA-3′，反向引物為5′-CGGCAACTGCAATCCTT-3′；MMP-3正向引物為5′-CTGGGCCAGGGATTAATGGA-3′，反向引物為5′-AGGGGGAGGTCCATAGAGGG-3′；MMP-1正向引物為5′-GAAAGAAGACAAAGGCAAGTTGA-3′，反向引物為5′-CTCTTGGCAAATCTGGCGTG-3′；VEGF正向引物為5′-GGCCTCTGAAACCATGAACT-3′，反向引物為5′-ATGCTGCAGGAAGCTCATCT-3′；IL-11正向引物為5′-ACATGAACTGTGTTTGCCGC-3′，反向引物為5′-GAATCCAGGTTGTGGTCCCC-3′；IL-8正向引物為5′-AGAGTGGACCACACTGCGC-3′，反向引物為5′-ATTGCATCTGGCAACCCTACA-3′；IL-18正向引物為5′-AAGATGGCTGCTGAACCAGT-3′，反向引物為5′-GTCCGGGGTGCATTATCTCT-3′；CCL2正向引物為5′- TCCCAAAGAAGCTGTGATCTTCA-3′，反向引物為5′- TCTGGGGAAAGCTAGGGGAA-3′；CCL5正向引物為5′- TCATTGCTACTGCCCTCTGC-3′，反向引物為5′-TCCTTGACCTGTGGACGACT-3′；CXCL10正向引物為5′- CCACGTGTTGAGATCATTGCT-3′，反向引物為5′- TGCATCGATTTTGCTCCCCT-3′；GAPDH正向引物為5′-GAAAGCCTGCCGGTGACTAA-3′，反向引物為5′-GCCCAATACGACCAAATCAGAG-3′。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸35 s，共40個循環(huán)。以2-ΔΔCt表示目的基因mRNA的相對表達(dá)量。每組實驗重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 各組宮頸組織中TINs百分比比較 TINs在對照組、CINⅠ組、CINⅡ/Ⅲ組、SCC組宮頸組織中的百分比依次升高，分別為14.36%±2.09%、20.57%±3.86%、33.61%±5.94%、56.71%±8.13%，兩兩相比，P均<0.05。

2.2 各組宮頸組織中CD66b+TINs、CD8+T百分比比較 CD66b+TINs在對照組、CINⅠ組、CINⅡ/Ⅲ組、SCC組中的百分比依次升高，分別為8.07%±1.63%、10.97%±2.98%、15.71%±3.47%、24.83%±4.29%，兩兩相比，P均<0.05。CD8+T細(xì)胞在各組宮頸病變組織中的百分比呈先增高后下降趨勢，分別為7.41%±1.35%、10.13%±3.22%、6.36%±2.51%、3.07%±1.09%，兩兩相比，P均<0.05。CINⅡ/Ⅲ組、SCC組CD66b+TINs與CD8+T百分比均呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.139、-0.275，P均<0.05)。

2.3 SCC組中CD66b+TINs高表達(dá)組和CD66b+TINs低表達(dá)組腫瘤促進(jìn)因子mRNA的表達(dá)比較 CD66b+TINs高表達(dá)組的MMP-9、MMP-3、MMP-1、VEGF、IL-11、IL-8、IL-18、CCL2、CCL5、CXCL10 mRNA相對表達(dá)量均高于CD66b+TINs低表達(dá)組，兩者相比，P均<0.05，詳見表1。

表1 SCC組織中腫瘤促進(jìn)因子的mRNA相對表達(dá)量比較

2.4 SCC組宮頸癌組織中CD66b+TINs表達(dá)與SCC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 SCC組中CD66b+TINs的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，與患者的年齡、腫瘤直徑、腫瘤分化程度及臨床分期無關(guān)(P均>0.05)，詳見表2。

表2 SCC組宮頸癌組織中CD66b+ TINs表達(dá)與 SCC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3 討論

炎癥通過促進(jìn)或抑制血管的生成和轉(zhuǎn)移在癌癥發(fā)展中起關(guān)鍵作用[11]。在總循環(huán)白細(xì)胞中占優(yōu)勢比例的嗜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞在宿主全身免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用，但其對腫瘤進(jìn)展的作用大部分在腫瘤微環(huán)境中實現(xiàn)。TINs參與癌癥發(fā)生和進(jìn)展[12～15]。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)血液中中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的比值與許多惡性腫瘤疾病的進(jìn)展有關(guān)[16]。特異性酯酶染色陽性反應(yīng)僅出現(xiàn)在各階段的粒細(xì)胞中，而且絕大部分的粒細(xì)胞是嗜中性粒細(xì)胞[3, 4]。故本研究通過特異性酯酶染色法檢測不同病理宮頸組織中TINs的浸潤情況，以明確中性粒細(xì)胞在不同病理宮頸組織中的變化趨勢。本研究結(jié)果顯示，在不同病理宮頸組織中，特異性酯酶染色陽性結(jié)果清晰可見，并觀察到TINs的浸潤數(shù)呈逐漸升高趨勢，提示TINs參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。

CD8+T細(xì)胞是抗腫瘤免疫最重要的效應(yīng)機(jī)制之一，是腫瘤組織中浸潤的主要淋巴細(xì)胞[17]。在動物模型和人類中，CD8+T細(xì)胞已被證明在宿主抵抗惡性腫瘤的防御中發(fā)揮重要作用[18]。本研究結(jié)果顯示，宮頸腫瘤組織中CD66b+TINs與CD8+T的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示在宮頸腫瘤微環(huán)境中TINs浸潤與細(xì)胞免疫抑制狀態(tài)有關(guān)。

TINs具有兩種表型：N1型和N2型。N1型為抑瘤型，可產(chǎn)生次氯酸和活性氧直接殺傷腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[19, 20];N2型為促瘤型，能夠分泌組織降解酶、血管內(nèi)皮生長因子、細(xì)胞因子及趨化因子對腫瘤發(fā)展起促進(jìn)作用[4]。國外研究[21, 22]報道，腫瘤微環(huán)境中浸潤的TINs主要是N2型，N2型TINs可產(chǎn)生大量精氨酸酶，滅活T細(xì)胞效應(yīng)器功能，對CD8+T細(xì)胞起免疫抑制作用，從而使腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視。N2型TINs通過產(chǎn)生組織降解酶類(MMPs)和VEGF改善細(xì)胞外基質(zhì)并增強(qiáng)血管生成的能力，以支持腫瘤細(xì)胞增殖、抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤生長。MMPs是一類與鋅結(jié)合的具有降解細(xì)胞外基質(zhì)活性的酶家族，MMP-9、MMP-3、MMP-1是其中重要成員，在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用[23]。中性粒細(xì)胞經(jīng)活化后可分泌VEGF，誘導(dǎo)腫瘤血管的生成[24]。腫瘤細(xì)胞可分泌細(xì)胞因子IL-8促進(jìn)N2型TINs的浸潤，反過來N2型TINs促進(jìn)腫瘤的生長，形成惡性循環(huán)[25]。炎性環(huán)境中的細(xì)胞因子可介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的生長，人類中性粒細(xì)胞胞質(zhì)中含有IL-18，IL-18是一種促炎細(xì)胞因子，在先天免疫和適應(yīng)性免疫中都起作用。IL-11是IL-6超家族成員之一，在動物體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)，小鼠腹腔內(nèi)注射IL-11能上調(diào)小鼠胃竇部組織內(nèi)多種組織降解酶類(MMP-9、MMP-3)的表達(dá)[26]，IL-11有可能通過促進(jìn)MMP-9、MMP-3合成，參與促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。趨化因子是一組具有趨化作用的分泌型單鏈蛋白，參與炎癥反應(yīng)的各個階段，其主要是通過不同的趨化因子受體將白細(xì)胞歸巢到炎癥組織和部位, 還激活整合素、刺激介質(zhì)釋放、調(diào)節(jié)血管, 因此趨化因子在炎癥過程中發(fā)揮中心作用[27]。CCL2主要促進(jìn)炎癥細(xì)胞向炎癥區(qū)域聚集;腫瘤細(xì)胞亦可釋放CCL5、CXCL10等，招募嗜中性粒細(xì)胞的浸潤。本研究中，選取與TINs相關(guān)的代表性腫瘤促進(jìn)因子，通過RT-qPCR技術(shù)檢測宮頸癌組織中腫瘤促進(jìn)因子的mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示在宮頸癌患者TINs高表達(dá)組中腫瘤促進(jìn)因子的表達(dá)均高于TINs低表達(dá)組，說明在不同宮頸病理組織中，TINs通過產(chǎn)生或趨化多種腫瘤促進(jìn)因子促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，宮頸組織癌變過程中TINs浸潤增加；TINs浸潤增加抑制了宮頸組織微環(huán)境中免疫細(xì)胞CD8+T的表達(dá)，同時可產(chǎn)生或趨化多種腫瘤促進(jìn)因子，直接或間接導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。后續(xù)我們將進(jìn)一步探討TINs在分子水平的作用機(jī)制，為宮頸癌的早期診治提供新的靶標(biāo)。