張 帆,張晨紅

(陜西省核工業(yè)215醫(yī)院,陜西 咸陽 712000)

急性腦梗死也稱作缺血性腦卒中，是由于腦部血管動(dòng)脈粥樣硬化而導(dǎo)致的血管狹窄以及閉塞，繼而出現(xiàn)腦組織缺氧以及缺血性壞死引發(fā)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，臨床以血瘀證為主要證型。急性腦梗死的發(fā)病過程與炎性反應(yīng)、自由基增加、鈣水平異常升高、細(xì)胞凋亡等因素密切相關(guān)，而T-bet與GATA-3免疫平衡與該病的關(guān)系尚不十分明確[1]。有研究證實(shí)，醒腦靜注射液用于急性腦梗死的治療效果較好[2]。故本研究觀察了醒腦靜注射液對血瘀證急性腦梗死患者外周單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中T-bet與GATA-3表達(dá)情況的影響，期望能夠?yàn)榧毙阅X梗死的治療更多參考依據(jù)。

1 臨床資料

1.1一般資料 選擇我院2015年9月—2016年12月收治的急性腦梗死患者80例，均符合《全國第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議紀(jì)要》[3]中制定的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，均參照《血瘀證中西醫(yī)結(jié)合診療共識》[4]判定為血瘀證，患者均在發(fā)病24 h內(nèi)住院治療，在發(fā)病48 h內(nèi)意識較為清晰或者存在輕度障礙。排除肝、腎、肺、心存在功能性問題者，合并心肌梗死、糖尿病、心律失常者，合并慢性感染性疾病、腦部腫瘤、免疫風(fēng)濕性疾病者，CT或者M(jìn)RI診斷為腦出血與蛛網(wǎng)膜下腔出血者。本次臨床研究上報(bào)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)獲得批準(zhǔn)，所有患者及家屬均簽署知情同意書。隨機(jī)將80例入選者分為2組：觀察組40例，男24例，女16例；年齡45～80(60.73±5.81)歲；發(fā)病至入院時(shí)間(16.49±5.24)h；存在吸煙史者16例，高血壓病史者17例。對照組40例，男22例，女18例；年齡44～82(60.59±5.66)歲；發(fā)病至入院時(shí)間(16.54±5.33)h；存在吸煙史者17例，高血壓病史者18例。2組患者的性別比、年齡、發(fā)病時(shí)間等資料比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，均衡性較好。

1.2治療方法 對照組患者在入組后給予抗凝、保護(hù)腦神經(jīng)等常規(guī)治療，其中阿司匹林片(昆明制藥集團(tuán)金泰得藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H53021985，規(guī)格：0.5 g/片)每晚0.3 g口服，持續(xù)服藥1周后改為每次0.1 g，阿托伐他汀鈣片(輝瑞制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20051407，規(guī)格：10 mg/片)每晚40 mg。觀察組患者入組后在常規(guī)治療基礎(chǔ)上給予醒腦靜注射液(大理藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字Z53021636，規(guī)格：10 mL/支)30 mL加入0.9%氯化鈉注射液250 mL中靜脈滴注。2組均持續(xù)治療2周為1個(gè)療程。

1.3觀察指標(biāo) ①PBMC中T-bet與GATA-3表達(dá)情況：分別于治療前后抽取2組患者的清晨空腹外周靜脈血15 mL，在肝素抗凝處理后，以Ficoll密度梯度離心方法提取外周血中的淋巴細(xì)胞，分離PMBC，在1640培養(yǎng)液中洗滌2次后重懸制備PBMC。采用RT-PCR法測定PBMC中T-bet mRNA與GATA-3 mRNA表達(dá)情況：選擇Trizol試劑提取總RNA，采用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶法合成cDNA，將3μg總RNA加入RT反應(yīng)體系試管中，RT反應(yīng)體系包含1 μL的M-MLV、1μL的RNasin、1μL的Random Primers、5 μL的5×MMV Buffer、2.5 μL的4×dNTPs，在試管中以DEPC水補(bǔ)充容量，最終反應(yīng)液體積為25 μL，在混合均勻后離心處理。在43 ℃的環(huán)境下靜置30 min，在99 ℃的條件下靜置5 min后，保存在-40 ℃的環(huán)境中。選擇PCR擴(kuò)增儀測定PBMC中T-bet mRNA與GATA-3 mRNA表達(dá)水平，內(nèi)部參考選擇β-actin。引物序列中T-bet的上游引物為5’-CCGTGACTGCCTACCAGAAT-3’，下游引物為5’-TCATGCTGACTGCGCGAAAC-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為312 dp。GATA-3的上游引物為5’-AGGCAGGGAGTGTGTGAACT-3’，下游引物為5’-TTTTTCGGTTTCTGGTVTGG-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為326 bp。β-actin上游引物為5’-GTGGGCCGCCGACACCA-3’，下游引物為5’-CGGTTGGCCTTGGGATTGAG-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為247 bp。反應(yīng)體系選擇為25 μL，在94 ℃預(yù)變性處理2 min，30 s 94 ℃、50 s 60 ℃、1 min 72 ℃循環(huán)，持續(xù)25個(gè)循環(huán)，在73 ℃中延伸處理3 min。在濃度為1.2%的瓊脂糖凝膠中加入10 μL的擴(kuò)增產(chǎn)物，在100 V的電泳環(huán)境下處理20 min,采用圖像分析軟件分析各條帶的平均灰度值，以擴(kuò)增的β-actin為內(nèi)參照，計(jì)算各指標(biāo)的相對表達(dá)量。②生活質(zhì)量：分別于治療前及治療第3，5，7天以改良Barthel指數(shù)(MBI)評分[5]評價(jià)2組患者生活質(zhì)量。③統(tǒng)計(jì)2組治療過程中不良反應(yīng)發(fā)生情況。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 15.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)數(shù)資料比較采用2檢驗(yàn)；計(jì)量資料采用表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.12組治療前后血清T-betmRNA、GATA-3 mRNA、T-bet/GATA-3表達(dá)情況比較 2組治療前T-betmRNA、GATA-3 mRNA與T-bet/GATA-3表達(dá)情況比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。治療1個(gè)療程后，2組T-betmRNA、T-bet/GATA-3表達(dá)水平均明顯降低(P均<0.05)，GATA-3 mRNA表達(dá)水平均明顯升高(P均<0.05)；觀察組治療后T-bet mRNA、T-bet/GATA-3表達(dá)水平均明顯低于對照組(P均<0.05)，GATA-3 mRNA表達(dá)水平均明顯高于對照組(P均<0.05)。見表1。

2.22組治療前后MBI評分比較 2組治療前MBI評分比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，2組治療3 d、7 d、14 d后MBI評分均明顯高于治療前(P均<0.05)，且觀察組明顯高于對照組(P均<0.05)。見表2。

表1 2組治療前后PBMC中T-bet mRNA、GATA-3 mRNA與T-bet/GATA-3表達(dá)情況比較

表2 2組治療前后MBI評分比較分)

注：①與治療前比較，P<0.05。

2.32組治療過程中不良反應(yīng)發(fā)生情況比較 對照組患者治療中出現(xiàn)頭痛2例，心悸1例，不良反應(yīng)發(fā)生率為7.5%；觀察組患者治療中出現(xiàn)頭痛1例，皮膚過敏1例，不良反應(yīng)發(fā)生率為5.0%。2組不良反應(yīng)發(fā)生率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=0.709,P>0.05)。

3 討 論

急性腦梗死屬于中醫(yī) “中風(fēng)”范疇，早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中就有相似疾病名稱的論述。主要的致病機(jī)制是血?dú)饽鎭y，瘀血阻滯，所以血瘀證是急性腦梗死的主要中醫(yī)證型。醒腦靜注射液是在安宮牛黃丸的基礎(chǔ)上改進(jìn)的水溶性中藥注射制劑，主要成分為梔子、麝香、冰片、郁金等。其中麝香氣味芬芳，具有良好的通痹開竅功效，是回蘇醒神的主要藥物[6]。而冰片性微寒而味辛苦，能夠疏散郁火而通諸竅，與麝香配合能夠有效開竅醒神[7]。梔子則能夠通瀉三焦之火，具有解毒利濕、涼血清熱的功效[8]。郁金能夠止痛祛瘀活血、解郁涼血、行氣清心[9]。多種藥物聯(lián)合作用，可以有效發(fā)揮活血祛痰、開竅醒神、解毒清熱的功效。本研究中，觀察組應(yīng)用醒腦靜注射液治療2周后，患者的生存質(zhì)量MBI評分明顯高于治療前及同期對照組，表明聯(lián)合醒腦靜注射液治療相比單純西藥治療可以有效改善患者生存質(zhì)量，對疾病康復(fù)有積極作用。

急性腦梗死患者發(fā)病后的炎性癥狀以及免疫系統(tǒng)反應(yīng)導(dǎo)致的機(jī)體炎性因子水平升高，是腦梗死區(qū)域以及缺血性半暗帶區(qū)域的神經(jīng)元損傷主要原因[10]。而其中T細(xì)胞免疫功能紊亂是急性腦梗死發(fā)病中的重要因素[11]，Th1與Th2細(xì)胞因子的平衡失調(diào)與急性腦梗死的發(fā)病以及進(jìn)展有著密切關(guān)系[12]。Th1與Th2細(xì)胞亞群都是通過Th0前體細(xì)胞分化產(chǎn)生的，T-bet與GATA-3是Th1與Th2細(xì)胞分化的主要調(diào)節(jié)因子，在Th1與Th2細(xì)胞中表達(dá)呈現(xiàn)出特異性，二者是細(xì)胞分化過程中具有相反方向調(diào)控作用的因子[13-14]。T-bet與GATA-3能夠決定Th前體細(xì)胞是分化成為Th1或者是Th2細(xì)胞，所以說轉(zhuǎn)錄因子T-bet與GATA-3是確定Th0細(xì)胞分化方向的具體指標(biāo)，而T-bet/GATA-3比值能夠反映Th1/Th2的分化情況，相比單一的因子表達(dá)更加客觀，能夠確定Th1與Th2的免疫平衡狀態(tài)。T-bet與GATA-3還可以與不同炎癥因子相結(jié)合，構(gòu)成相互調(diào)節(jié)的環(huán)狀通路，實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)的功能。近年來的研究中發(fā)現(xiàn)，通過有效的干預(yù)方法可以調(diào)節(jié)T-bet/GATA-3的信號傳導(dǎo)通路，進(jìn)而改變二者的活性水平，完成Th1與Th2平衡的調(diào)節(jié)[15]。本研究中，治療后觀察組PMBC中T-bet mRNA表達(dá)水平明顯降低，而GATA-3 mRNA表達(dá)水平明顯升高，T-bet/GATA-3比值明顯降低。表明醒腦靜注射液可以在細(xì)胞分化的最初過程發(fā)揮作用，可以有效抑制Th1的免疫反應(yīng)，調(diào)節(jié)Th1/Th2失衡的免疫反應(yīng)逐漸向Th2傾斜，緩解免疫系統(tǒng)功能失衡狀態(tài)。

綜上所述，醒腦靜注射液輔助治療血瘀證急性腦梗死，可發(fā)揮T-bet/GATA-3的雙向調(diào)節(jié)作用，從而恢復(fù)Th1與Th2細(xì)胞亞群的免疫平衡，改善患者生存質(zhì)量，安全性也較好。但是醒腦靜注射液對患者T-bet/GATA-3平衡調(diào)節(jié)的具體機(jī)制還沒有完全明確，需要更多的研究支持。