李文謙，盧康，茅燕勇，陳大兵

（1.淮陰工學(xué)院，江蘇淮安223003；2.淮安市三商農(nóng)業(yè)科技有限公司，江蘇淮安223300）

磷是植物生長不可或缺的營養(yǎng)物質(zhì)之一，對于植物的代謝生長起著重要的促進作用[1]。但是，土壤中能被植物直接吸收促進其生長的磷的含量非常低，且植物能吸收利用的有效磷量很少，不到土壤中所有磷的1%[2]。解磷微生物能夠?qū)⑼寥乐胁荒芪绽玫牧邹D(zhuǎn)化為可吸收利用的磷，提高土壤中植物可利用磷的含量。另外，它可使土壤中的一些微量元素成為可促進植物生長的形式，如鐵、鋅等[3-5]。解磷微生物能轉(zhuǎn)化可溶磷的原因，主要是其在代謝過程中產(chǎn)生了多種有機酸，如草酸、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸和琥珀酸等，與此同時，有機酸和一些微量元素螯合，使得營養(yǎng)物質(zhì)pH下降，酸度升高，磷酸鹽得以溶解[6-7]。另外，解磷微生物代謝過程中分泌的磷酸酶、蛋白質(zhì)、多糖等，也可能與解磷微生物的解磷效果有關(guān)[8]。本文采用在淮安果園土壤中篩選獲得的高效解磷菌，對其發(fā)酵培養(yǎng)，測定發(fā)酵液中的有機酸濃度、磷酸酶活性、蛋白質(zhì)含量、多糖含量等，初步研究該解磷菌的代謝產(chǎn)物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

枯草芽孢桿菌，為實驗室篩選解磷菌。

1.1.2 培養(yǎng)基

活化培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基）：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，加入去離子水1L，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：10g，硫酸銨5g，氯化鈉0.3g，氯化鉀0.3g，七水合硫酸鎂0.3g，七水合硫酸亞鐵0.03g，一水合硫酸錳0.03g，磷酸二氫鉀（磷酸三鈣或卵磷脂等）2g，定容至1000mL，，pH7.0～7.5。

1.2 方法

1.2.1 有機酸含量的測定

用量筒準確量取10mL經(jīng)過10000r/min離心10min的發(fā)酵液，轉(zhuǎn)移到100mL的容量瓶中，用去離子水定容、搖勻，待用。準確吸取稀釋樣液20mL于150mL三角瓶中，加入1%的酚酞2滴，用裝有0.05mol/L的氫氧化鈉的堿式滴定管滴定，滴定直至溶液的顏色剛剛顯粉色，30s內(nèi)不褪色就完成滴定，記下滴定所用的氫氧化鈉的體積。有機酸含量(%)=kcV/10×100%，式中，c為NaOH濃度 (mol/L)，k為換算系數(shù)，取0.064，V為消耗NaOH液量(mL)。3次重復(fù)，取平均值。

1.2.2 磷酸酶活性的測定

標準曲線的制作:分別吸取標準對硝基酚溶液0、l、2、3、4、5ml于試管中，定容至5ml。加1mL的0.5mol/L的氯化鈣溶液和4mL的0.5mol/L氫氧化鈉溶液,420nm比色。繪制標準曲線，計算標準曲線的回歸方程及R2值：Y=0.6688X-0.0008 (R2=0.9997)。

用移液槍吸取1mL經(jīng)過10000r/min離心10min的發(fā)酵上清液于干凈試管中，加入4mL MUB(檢測酸性磷酸酶時所用的MUB試劑的pH為6.5，檢測堿性磷酸酶時所用的MUB試劑的pH為11），再加用相同pH的緩沖液配制成的1mL對硝基苯磷酸二鈉溶液，振蕩幾秒鐘混勻，塞住瓶塞，在恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)1 h，取出打開瓶塞，分別加入1mL的0.5mol/L的氯化鈣溶液和4mL的0.5mol/L氫氧化鈉溶液，震蕩后用濾紙過濾懸液，將澄清濾液在420nm處比色，。由標準曲線換算得相應(yīng)的磷酸酶活性。

1.2.3 多糖、蛋白質(zhì)含量測定

分別采用硫酸-苯酚法、考馬斯亮藍法測定發(fā)酵液中的多糖、蛋白質(zhì)含量[9-10]。

用分析天平準確稱取標準葡萄糖20mg于500ml容量瓶中，加去離子水定容至刻度，搖勻。分別吸取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 及 0.9ml該溶液于比色管中，各以去離子水補至1.0ml，然后各加入6%的苯酚0.5ml及濃硫酸2.5ml，搖勻冷卻，室溫放置20min后，于490nm處測吸光度值以1ml去離子水為空白組按上述操作調(diào)零。以多糖微克數(shù)為橫坐標，縱坐標為吸光度值，繪制標準曲線。計算標準曲線的回歸方程及R2值：Y=10.029X-0.0095(R2=0.994)。將發(fā)酵液離心取0.2ml上清液，按上述標準曲線中的操作方法測定，以上述空白組調(diào)零，在490nm處測吸光度值，然后按回歸方程計算待測溶液中的多糖濃度。

取6支比色管分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml的0.1mg/ml的標準蛋白質(zhì)溶液，再各用去離子水補齊至1ml,后分別加入5ml考馬斯亮藍溶液，混合均勻，靜置5min后用1cm光徑比色杯在595nm下比色，一小時內(nèi)完成比色。橫坐標為蛋白質(zhì)濃度，以吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。計算標準曲線的回歸方程及R2值：Y=4.9543X+0.006(R2=0.999)。發(fā)酵液離心1ml上清液，加入5ml考馬斯亮藍溶液，搖勻靜置5min，以上述空白管調(diào)零，于595nm處比色，由標準曲線計算發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)濃度。

1.2.4 可溶性磷含量的測定

用移液管分別準確吸取5mg/L的磷標準溶液0、2、4、6、8、10ml于潔凈的1-6號50ml容量瓶中，用去離子水補齊至10ml，再加入二硝基酚指示劑2-3滴，并用100g/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至溶液剛呈微黃色，用移液槍準確加入5ml鉬銻鈧顯色劑，搖勻，加去離子水定容，于室溫15℃以上，放置30min。在波長700nm處，測定其吸光度，以吸光度值為縱坐標，磷濃度(mg/L)為橫坐標，繪制標準曲線。計算標準曲線的回歸方程及R2值：Y=0.4956X+0.0027(R2=0.999)。

將待測發(fā)酵液經(jīng)10000r/min離心10min，取2mL上清液移至50mL容量瓶中，用水稀釋至總體積約3/5處，滴加二硝基酚指示劑1～2滴，并用100g/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至溶液剛呈微黃色，用移液槍準確加入5mL鉬銻鈧顯色劑，搖勻，加去離子水定容，室溫15℃以上，放置30min。顯色的發(fā)酵液進行比色測定，讀取吸光度值，再由回歸方程計算得相應(yīng)的含磷量[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同磷源發(fā)酵液中有機酸濃度的變化

有機酸是一類酸性有機化合物，能夠解離出游離的氫離子，氫離子和磷酸根結(jié)合形成可溶性磷酸鹽，同時，有機酸根離子能夠與金屬離子結(jié)合從而釋放無機磷。不同磷源發(fā)酵液中有機酸濃度的變化如圖1所示，3種磷源的發(fā)酵液中的有機酸濃度都隨發(fā)酵時間延長而出現(xiàn)一定程度的上升，但空白無磷源的發(fā)酵液中的有機酸含量遠小于有磷源的發(fā)酵液中的有機酸含量。以磷酸鈣為唯一磷源時的發(fā)酵液中有機酸含量最高，達33.1mg/L。

圖1 不同時間段磷源的發(fā)酵液中有機酸濃度

2.2 不同磷源發(fā)酵液中磷酸酶活性的變化

酸性磷酸酶能夠從不同的有機磷底物上水解磷酸基團，釋放出無機磷供植物吸收利用。堿性磷酸酶可以催化幾乎所有的磷酸單酯的水解反應(yīng)，生成無機磷酸和相應(yīng)的醇、酚、糖等，促進植物生長繁殖。不同磷源發(fā)酵液中磷酸酶活性的變化如圖2和圖3所示，隨著發(fā)酵的進行，不同磷源中的磷酸酶活性均呈現(xiàn)緩慢下降趨勢。無磷源的發(fā)酵液中磷酸酶活性較低，有磷源的發(fā)酵液中的磷酸酶活性遠高于無磷狀態(tài)，其中以磷酸二氫鉀和磷酸鈣為磷源時的發(fā)酵液中磷酸酶活性相差不大，但以卵磷脂為唯一磷源時的磷酸酶活性則明顯高于兩者。這說明磷酸酶的活性在發(fā)酵初期比較高，隨著發(fā)酵的時間的增長，磷酸酶活性緩慢下降，因此磷酸酶是枯草芽孢桿菌的解磷物質(zhì)，與解磷效果密切相關(guān)，但主要作用在解磷前期。

2.3 不同磷源發(fā)酵液中多糖含量的變化

由圖4可知，不同磷源條件下，枯草芽孢桿菌均產(chǎn)生一定濃度的多糖，發(fā)酵液中多糖含量呈先下降后上升的趨勢。其中以卵磷脂為唯一磷源時的多糖含量最高，達54.2mg/L?？莶菅挎邨U菌溶解有機難溶磷產(chǎn)生的多糖高于溶解無機難溶磷。

2.4 不同磷源發(fā)酵液中蛋白質(zhì)濃度的變化

添加不同種類磷源條件下培養(yǎng)枯草芽孢桿菌一定時間，測定其蛋白質(zhì)濃度，結(jié)果見圖5。由圖5可知，在3種不同磷源條件下，以卵磷脂為唯一磷源時的蛋白質(zhì)濃度最高，為51mg/L，而空白不含磷源的發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)含量極低，僅有10.1mg/L。這就表明蛋白質(zhì)可能也是枯草芽孢桿菌溶解難溶磷的重要代謝產(chǎn)物之一，影響著枯草芽孢桿菌的解磷效果。

圖2 不同時間段磷源發(fā)酵液中酸性磷酸酶活性

圖3 不同時間段磷源發(fā)酵液中堿性磷酸酶活性

圖4 不同時間段磷源發(fā)酵液中多糖含量

2.5 不同磷源發(fā)酵液中磷含量的變化

在不同磷源條件下發(fā)酵液中可溶性磷含量如圖6所示。由圖6可見，發(fā)酵液中磷含量都呈上升趨勢，空白無磷的發(fā)酵液中可溶磷含量最低，僅達到0.041mg/L，以卵磷脂為唯一磷源的可溶磷含量最高，達0.956mg/L。說明枯草芽孢桿菌對不同形態(tài)的難溶磷的溶解能力存在差異。

3 結(jié)論

在外界磷源的誘導(dǎo)下，解磷菌在代謝過程中產(chǎn)生有機酸而發(fā)揮其溶解外界磷元素的能力。本文對不添加磷源、磷酸二氫鉀、碳酸鈣和卵磷脂4種不同培養(yǎng)基中解磷菌的代謝產(chǎn)物進行了比較分析，發(fā)酵液中有機酸含量最高為33.1mg/L，酸性磷酸酶含量最高達242.6μmol/(L·h)，多糖含量最高達54.2mg/L，蛋白質(zhì)含量最高達51mg/L，磷含量最高達0.956mg/L。

圖5 不同時間段磷源發(fā)酵液中蛋白質(zhì)濃度

圖6 不同時間段磷源發(fā)酵液中磷含量