何健，廖祖華，李小娟，戴金玉，高益槐

（安發(fā)（福建）生物科技有限公司，福建省天然生物活性物質(zhì)企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建寧德 352100）

三萜類化合物是靈芝的主要活性成分，研究表明，靈芝三萜酸具有抑制癌細(xì)胞增殖、抗病毒、抑菌、解毒保肝等功能[1-4]。通過液體深層發(fā)酵獲得靈芝三萜酸，具有周期短、含量穩(wěn)定、組分一致等特點(diǎn)。李平作等[5]在25 L發(fā)酵罐進(jìn)行靈芝深層發(fā)酵，分離得到四環(huán)三萜酸，命名靈芝酸M1-3，產(chǎn)量是0.36 g/L。曠思敏等[6]通過對發(fā)酵條件的優(yōu)化，搖瓶發(fā)酵靈芝三萜酸產(chǎn)量為0.50 g/L。王曉玲等[7]構(gòu)建了靈芝三萜酸分批發(fā)酵的非結(jié)構(gòu)動力學(xué)模型，靈芝三萜酸的合成和細(xì)胞生長呈現(xiàn)部分偶聯(lián)關(guān)系。

在靈芝的生產(chǎn)放大過程中，種子培養(yǎng)的質(zhì)量和生物量是重要制約因素[8]。在培養(yǎng)過程中，靈芝孢子生長出菌絲，由菌絲聚集纏繞形成菌絲球。隨著菌絲生長和流體流動，菌絲球會增大，并通過菌絲斷裂，形成新的菌絲球。生長初期體積小的菌絲球得到充足的氧和營養(yǎng)供應(yīng)，隨著其體積的增大，傳遞到中心的氧受到限制。由于菌絲球直徑超過一定大小后就會產(chǎn)生氧限制，在無氧條件下會形成乙醇，而較長時(shí)間的氧限制會導(dǎo)致菌絲球自溶[9]。通過對發(fā)酵種子培養(yǎng)的菌絲球進(jìn)行破碎，可在對數(shù)生長期具有更多的生長點(diǎn)、菌絲球獲得更充足的氧和營養(yǎng)供應(yīng)。

本文擬以三萜酸含量為主要指標(biāo)，對靈芝三萜酸深層發(fā)酵的種子培養(yǎng)過程中菌絲球破碎工藝進(jìn)行研究，為靈芝三萜酸發(fā)酵種子的快速擴(kuò)大培養(yǎng)、生產(chǎn)的規(guī)模化提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

靈芝NA34，赤芝G.10016+2，由福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心提供，安發(fā)（福建）生物科技有限公司重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室篩選保藏。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）。

種子培養(yǎng)基（包括一級和二級培養(yǎng)）：葡萄糖35 g/L、蛋白胨5 g/L、酵母粉 5 g/L，KH2PO41 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L，pH自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖41 g/L、玉米粉17 g/L、豆餅粉5 g/L、蛋白胨4 g/L，KH2PO41.5 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L，調(diào)節(jié) pH 至 5.50。

1.3 主要設(shè)備

LRH-150F生化培養(yǎng)箱（上海一恒儀器有限公司），ZWY-1102C恒溫?fù)u床（上海智城分析儀器制造有限公司），JY92-IIN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技有限公司），UV-2600紫外分光光度計(jì)（日本島津公司），BLBIO-50SJQ 50L發(fā)酵罐（上海百侖生物科技有限公司）。

1.4 培養(yǎng)條件

菌種活化：將保藏的菌種接種到斜面培養(yǎng)基上，置于生化培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)5天。

一級種子培養(yǎng)：用接種耙取出已活化的斜面菌種并搗碎，接種于裝有80 mL種子培養(yǎng)基的250 mL搖瓶，160 r/min、28 ℃培養(yǎng)4 d，即為一級種。

二級種子培養(yǎng)：將30 mL一級種接至裝有250 mL種子培養(yǎng)基500 mL搖瓶，160 r/min、28 ℃培養(yǎng)2 d，即為二級種。

發(fā)酵培養(yǎng)：將1 L二級種子液接種至裝有30 L發(fā)酵培養(yǎng)基50 L種子罐，發(fā)酵條件為160 r/min、溫度30 ℃、通氣量1 vvm、培養(yǎng)時(shí)間6 d。

1.5 分析方法

生物量的測定：取50 mL發(fā)酵液于8 000 r/min離心10 min，棄上清液，用蒸餾水洗滌菌絲體3次，60℃烘干至恒重得干燥菌絲體，精確稱重。

胞內(nèi)靈芝三萜酸含量的測定：將干燥獲得菌絲體用氯仿于750 W超聲波常溫提取2次，過濾合并濾液，減壓蒸干，用無水乙醇溶解，定容至容量瓶中。其三萜酸含量采用香草醛-高氯酸顯色法測定[10]。

菌絲球直徑測定：隨機(jī)選擇發(fā)酵液中20個(gè)菌絲球測量其直徑，取平均值。

1.6 菌絲球破碎工藝

對一級種分別采用超聲波破碎法和玻璃珠碾碎法，再接種于種子培養(yǎng)基進(jìn)行二級種培養(yǎng)，并與未進(jìn)行破碎工藝的結(jié)果進(jìn)行比較。

菌絲球超聲波破碎：選取按照1.4培養(yǎng)條件培養(yǎng)完成的一級種，于無菌條件下，將超聲波細(xì)胞破碎儀的探頭置于發(fā)酵液中650 W破碎6 s，再轉(zhuǎn)接至種子培養(yǎng)基進(jìn)行二級種培養(yǎng)，并發(fā)酵培養(yǎng)。

菌絲球玻璃珠碾碎：在配制好的一級種種子培養(yǎng)基中加入10個(gè)玻璃珠（直徑5 mm左右），再進(jìn)行培養(yǎng)基滅菌，按照培養(yǎng)方法培養(yǎng)一級種和二級種，并發(fā)酵培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌絲球破碎工藝對靈芝菌絲生長和發(fā)酵的影響

靈芝的絲狀菌絲在液體深層發(fā)酵中菌絲球的生理形態(tài)特征是重要的參數(shù)，通過菌絲球破碎，可改變菌絲球的直徑、增加菌絲增長點(diǎn)，進(jìn)而影響菌絲的比生長速率、生物量、發(fā)酵液流變學(xué)特性、菌絲體供氧情況。

將同一批活化的菌株采用不同的菌絲球破碎工藝，比較不同工藝條件下二級種的菌絲球直徑、生物量及發(fā)酵后三萜酸含量等參數(shù)，結(jié)果如表1所示。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，未進(jìn)行破碎菌絲球直徑為9.2 mm，超聲波破碎法和玻璃珠碾碎法菌絲球直徑分別為1.6 mm和6.2 mm，超聲波破碎法和玻璃珠碾碎法的生物量分別提高了60.3%和47.4%，三萜酸含量分別提高了53.6%和41.6%。

表1 不同的菌絲球破碎工藝對生長和發(fā)酵參數(shù)的影響

圖1 菌絲球形態(tài)

超聲波破碎法可快速地將菌絲球打碎，分散成短小的菌絲段，在二級種子培養(yǎng)中，菌絲可繼續(xù)生長，產(chǎn)生更多生長點(diǎn)，可獲得較高的生物量，且發(fā)酵得三萜酸含量也較高。

玻璃珠碾碎法可在菌絲體生長過程中，玻璃珠對菌絲體持續(xù)的碰撞、研磨，可控制菌絲球直徑，增加散落菌絲數(shù)量，產(chǎn)生更多生長點(diǎn)。采用此方法也可提高生物量，提高三萜酸產(chǎn)量，但比超聲波破碎法較低。

2.2 不同超聲條件對靈芝菌絲生長和發(fā)酵的影響

培養(yǎng)完成的一級種于無菌條件下，將超聲波細(xì)胞破碎儀的探頭置于發(fā)酵液中650 W破碎，超聲時(shí)間分別為0 s、3 s、6 s、9 s、12 s，再轉(zhuǎn)接至種子培養(yǎng)基進(jìn)行二級種培養(yǎng)，并發(fā)酵培養(yǎng)。

分析表2數(shù)據(jù)可知，超聲破碎時(shí)間與菌絲球直徑有負(fù)相關(guān)性，超聲破碎9s可獲得最大生物量，超聲破碎6 s三萜酸含量最高達(dá)320 mg/L。由于靈芝三萜酸為次級代謝產(chǎn)物，生物量與三萜酸含量沒有嚴(yán)格的相關(guān)性，故將三萜酸含量作為主要考察指標(biāo)，結(jié)合生物量情況，選擇超聲破碎6 s作為最適破碎條件。

2.3 添加玻璃珠的數(shù)量對靈芝菌絲生長和發(fā)酵的影響

在配制好的一級種種子培養(yǎng)基中分別加入0個(gè)、5個(gè)、10個(gè)、15個(gè)、20個(gè)、25個(gè)玻璃珠（直徑5 mm左右），再進(jìn)行培養(yǎng)基滅菌，按照培養(yǎng)方法培養(yǎng)一級種和二級種，并發(fā)酵培養(yǎng)。

表3 玻璃珠的數(shù)量對靈芝菌絲生長和發(fā)酵的影響

分析表3數(shù)據(jù)可知，提高玻璃珠數(shù)量有助于降低菌絲球直徑和提高生物量，加入20個(gè)玻璃珠可達(dá)最大生物量15.8 g/L和三萜酸含量305 mg/L，玻璃珠數(shù)量為10至25個(gè)時(shí)三萜酸含量可達(dá)最高值的97%以上。故250mL搖瓶裝液量80mL，加入20個(gè)玻璃珠進(jìn)行培養(yǎng)和發(fā)酵，生物量和靈芝三萜酸含量最高；加入玻璃珠數(shù)量為10至25個(gè)，可獲得較高的生物量和靈芝三萜酸產(chǎn)量。

表2 不同超聲破碎時(shí)間對靈芝菌絲生長和發(fā)酵的影響

3 結(jié)論

在靈芝菌絲體液態(tài)深層發(fā)酵培養(yǎng)過程中，種子搖瓶培養(yǎng)時(shí)，菌絲與菌絲球不斷纏繞，使菌絲球直徑不斷增大。菌絲不易斷裂，產(chǎn)生新菌絲球速率較慢，新增長點(diǎn)較少，得到菌絲球大小不一，菌絲球菌齡差異較大，制約了靈芝液態(tài)深層發(fā)酵的放大生產(chǎn)。

本實(shí)驗(yàn)通過考察超聲波破碎和玻璃珠碾碎兩種工藝對靈芝生長和靈芝三萜酸發(fā)酵的影響，研究發(fā)現(xiàn)兩種破碎方法均可降低菌絲球直徑，增加菌絲球數(shù)量，提高生物量和三萜酸含量。

采用超聲波破碎法，將超聲波細(xì)胞破碎儀的探頭置于靈芝種子培養(yǎng)液中650 W破碎6 s，可獲得最高靈芝三萜酸含量320 mg/L。此方法可快速高效地將菌絲體破碎，且對菌絲體生長影響小，可應(yīng)用于對菌種生物量有大量需求的生產(chǎn)中，可提高種子培養(yǎng)效率，提高菌種生物量，為靈芝三萜酸發(fā)酵階段提供基礎(chǔ)。但此方法為種子培養(yǎng)過程中進(jìn)行破碎處理，對細(xì)胞破碎機(jī)的超聲波探頭需嚴(yán)格無菌處理，操作不當(dāng)將大幅提高染菌風(fēng)險(xiǎn)。采用玻璃珠破碎法，250 mL搖瓶裝液量80 mL，加入20個(gè)玻璃珠進(jìn)行培養(yǎng)和發(fā)酵，生物量和靈芝三萜酸含量最高；加入玻璃珠數(shù)量為10至25個(gè)，可獲得較高的生物量和靈芝三萜酸產(chǎn)量。此方法操作簡單，在小試實(shí)驗(yàn)中有較好的效果，多用于少量的搖瓶培養(yǎng)。

通過研究菌絲球的破碎工藝對靈芝三萜酸液態(tài)發(fā)酵的影響，提供超聲波破碎法和玻璃珠破碎法兩種破碎工藝，可高效的提高菌絲的增長點(diǎn)，提高生物量，可為后續(xù)的靈芝三萜酸液態(tài)發(fā)酵研究提供基礎(chǔ)，同時(shí)也為廣大的絲狀真菌液態(tài)發(fā)酵的生產(chǎn)擴(kuò)大培養(yǎng)提供參考。