桂文龍， 蘇治國， 徐婷婷

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州 225300)

硝基呋喃類藥物主要用于抗細(xì)菌感染，也用于抗滴蟲感染[1]。硝基呋喃類化合物都具有一個(gè)5-硝基呋喃環(huán)的特征結(jié)構(gòu)，主要包含有呋喃它酮(AMOZ)、呋喃妥因(AHD)、呋喃西林(SEM)和呋喃唑酮(AOZ)等[2]。由于硝基呋喃類藥物的廣譜抗菌性，除了能抑制、滅殺大多數(shù)的革蘭陰性菌以外，還對大部分革蘭陽性菌也有殺傷作用[3-4]。硝基呋喃類抗菌藥藥效明顯、很難產(chǎn)生耐藥性，并且生產(chǎn)成本低廉，故而被大范圍用于畜牧業(yè)，在禁用前作為飼料添加劑治療豬、牛、禽類的胃腸道感染[5]。多年來研究表明，硝基呋喃類藥物具有基因毒性及致癌性，且其在動(dòng)物源性食品中的有害殘留也對人類健康存在一定風(fēng)險(xiǎn)。

應(yīng)用于硝基呋喃類藥物的色譜聯(lián)用技術(shù)主要有高效液相色譜-質(zhì)譜法和高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法[6]。其中，高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)是我國國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的檢測方法，滿足了0.5 μg/kg的檢測限[7]。HPLC-MS/MS法的原理是聯(lián)用高效液相色譜與質(zhì)譜，對物質(zhì)結(jié)構(gòu)定性并在定量限以上可以進(jìn)行定量分析。利用高效液相色譜將待測樣品中化合物分離并確定各化合物的濃度或含量進(jìn)行定量，再將其汽化后導(dǎo)入多級質(zhì)譜儀中進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，從而確定被高效液相色譜儀分離的各化合物的詳細(xì)分子結(jié)構(gòu)信息從而達(dá)到定性的目的。

1 儀器與試劑材料

1.1 主要儀器設(shè)

液相色譜-三級四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(WatersAcqutyUPLC-ThermoFisherTSQ)；組織勻漿機(jī)(JZ-Ⅱ型)；電子分析天平(AB204-N型)；多管渦旋振蕩器(Targin Technologies VX-2型)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(3K-30型)；水浴恒溫振蕩器(MAXQ4000型)；氮吹儀(TTL-DC11型)；酸度計(jì)(SevevExcellence系列)；有機(jī)相針式濾器(SCAA-104)；具塞離心管(50 mL、10 mL規(guī)格)；移液槍(5 mL、10 mL規(guī)格)；高純水發(fā)生器(MILLI-QADVANTAGE A10)。

1.2 主要試劑及配制

主要試劑有：對照品AOZ、AMOZ、AHD、SEM(純度均≥99.0%)；內(nèi)標(biāo)對照品AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-13C3、SEM-HCl-[1，2-15N213C](純度均≥99.0%)；2-硝基苯甲醛(分析純)；甲醇、乙酸乙酯、甲酸、乙醚、乙腈、磷酸鉀(均為色譜純)；濃鹽酸。主要試驗(yàn)用的試劑配制如下。

0.2 mol/L鹽酸溶液、1.0 mol/L磷酸鉀溶液和0.1%甲酸溶液按常規(guī)方法配制。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別精確稱取AOZ、AMOZ、AHD和SEM·HCl的標(biāo)準(zhǔn)對照品各0.01 g，置于4個(gè)100 mL棕色容量瓶中，用純甲醇溶解并定容，配制成濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-20 ℃以下保存。

內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液：用分析天平精確稱取AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-13C3和SEM-Hcl-[1，2-15N213C]對照品各 0.01 g，置于100 mL棕色容量瓶中，分別用甲醇溶解定容至刻度，稀釋成濃度為100 μg/mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，于-20 ℃以下保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液(100 ng/mL)：精確量取LAOZ、AMOZ、AHD和SEM·HCl標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各100 μL，混合于10 mL棕色容量瓶中，添加純甲醇直至10 mL刻度線，制得10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，再用80%甲醇稀釋成100 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，于4 ℃以下保存。

混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液(100 ng/mL)：精確量取AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-13C3和SEM-HCl-[1，2-15N213C]內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液100 μL，置于10 mL棕色容量瓶中混勻，用甲醇定容至刻度，制得100 μg/mL的混合內(nèi)標(biāo)中間工作液，再逐步稀釋為100 ng/mL的混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液于4 ℃下保存。

2 方法與步驟

2.1 待測試樣處理

(1)洗滌。稱取均質(zhì)后的供試試料2.00 g，于50 mL離心管中，每個(gè)試樣稱取1個(gè)平行樣。加10 mL 50%甲醇溶液，渦旋，中速振蕩10 min，然后6 000 r/min離心5 min，棄上清液；向離心管中加入10 mL 50%甲醇溶液，重復(fù)洗滌1次；用乙醚替代上述50%甲醇洗滌2次。(2)衍生。洗滌后試料加100 ng/mL的混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液20 μL；用刻度吸管加入0.2 mol/L鹽酸5 mL和0.1 mol/L 2-硝基苯甲醛的溶液 100 μL，渦旋振蕩混勻；于恒溫水浴振蕩器中設(shè)置37 ℃遮光反應(yīng)約16 h。(3)提取。將衍生后的試料放置于實(shí)驗(yàn)室冷卻至室溫(避光條件下進(jìn)行)，調(diào)節(jié)其pH值至中性(7.4左右)，所用的pH值調(diào)節(jié)劑是1 mol/L磷酸三鉀溶液，所需量大約為0.85 mL；加乙酸乙酯5 mL，進(jìn)行液液萃取，先渦旋，中速振蕩5 min后，高速冷凍離心機(jī)3 000 r/min離心10 min，上清液分層，吸取上層清液；用乙酸乙酯5 mL重復(fù)提取1次，合并上層清液；合并的乙酸乙酯層于40 ℃水浴下氮?dú)獯蹈?；?.1%甲酸水溶液1.0 mL溶解殘余物(若發(fā)現(xiàn)試樣混濁，可將試樣轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管，離心后吸取上清液)，經(jīng) 0.22 μm 的有機(jī)相針式濾器過濾后備用。

2.2 質(zhì)量控制樣品的制備

空白樣品：稱取2.00 g空白試樣，在衍生步驟中不添加混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液，其余步驟與待測試樣相同。

添加樣品：取空白試樣2.00 g，在上述待測試樣衍生步驟中再添加100 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液20 μL，其余操作相同，從而制得濃度為1.0 ng/g的陽性添加試料。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

精確量取上述試驗(yàn)試劑配制好的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液(100 ng/mL)0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mL分別置于5個(gè)10 mL容量瓶中，用5%乙腈(含0.1%甲酸)水溶液定容至刻度，混勻即得各濃度為1、2、4、8、10 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，按與待測試樣相同的色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)樣并進(jìn)行檢測，將測得的數(shù)據(jù)制作圖表得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，并換算出相關(guān)系數(shù)公式，求出該檢測方法的定量的線性范圍。

2.4 準(zhǔn)確度與精密度

分別精確量取100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液0.1、0.5、1.0 mL 于10 mL容量瓶內(nèi)，加0.1%甲酸水溶液直至容量瓶刻度線，從而制得序列濃度為1.0、5.0、10.0 ng/mL的溶液，每個(gè)濃度的溶液制備6個(gè)平行樣，分別進(jìn)樣檢測用于計(jì)算儀器回收率并得到相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

3 儀器參數(shù)與測定

3.1 色譜條件

色譜柱：Waters UPLCTM BEH C18柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；進(jìn)樣量：2 μL；柱溫：35 ℃；流動(dòng)相：A：乙腈；B：0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸溶液，梯度洗脫(梯度洗脫程序見表1)。

3.2 質(zhì)譜條件

離子源參考參數(shù)見表2。質(zhì)量分析器參考參數(shù)見表3。定性、定量離子對、錐孔電壓和碰撞能量見表4。

表1 液相色譜流動(dòng)相濃度梯度

注：曲線類型1為即時(shí)變化，6為線性變化。

表2 離子源參考參數(shù)

表3 質(zhì)量分析器參考參數(shù)

表4 硝基呋喃類代謝物衍生物和內(nèi)標(biāo)的定性、定量離子對、錐孔電壓和碰撞能量

4 結(jié)果與分析

4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣檢測，將標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度設(shè)為橫坐標(biāo)，將檢測得到的Area/IS Area比值設(shè)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程(圖1至圖4)。

由圖1至圖4可知，回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的r2范圍為0.999 478～0.999 679，r2>0.999 9。

4.2 回收率與精密度

方法回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差數(shù)據(jù)見表5。

由表5可知，各組的回收率在93.2%～106.1%之間，即絕對誤差范圍在1.12%～6.80%。結(jié)果顯示，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)處在0.83%～13.9%范圍內(nèi)。

表5 方法回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差數(shù)據(jù)(n=6)

4.3 檢測樣品藥物殘留

根據(jù)樣品前處理過程，選擇樣品進(jìn)行檢測，樣品編號(hào)為SX2017W0003，檢測結(jié)果見表6，該樣品未檢出硝基呋喃類藥物的代謝物。

表6 樣品SX2017W0003檢測結(jié)果

5 討論

5.1 樣品前處理過程

硝基呋喃類藥物在動(dòng)物體內(nèi)代謝，代謝物與豬肉中的蛋白質(zhì)鍵合在一起，所以若要檢測硝基呋喃類代謝物的殘留量則需要將該結(jié)合蛋白從樣品中分離出來，并分離出結(jié)合蛋白中的4種代謝物，為進(jìn)行下一步的儀器分析提供檢測目標(biāo)物。

前處理過程第1步洗滌的目的是除去樣品中游離可溶性雜質(zhì)及脂類物質(zhì)，甲醇作為蛋白質(zhì)沉淀劑與水同時(shí)存在可以沉淀蛋白質(zhì)，甲醇在水中溶解度很大，能破壞蛋白質(zhì)外表面的水化層，從而使蛋白質(zhì)相互聚集而沉淀。棄去上清液中游離的雜質(zhì)，再用乙醚洗滌，乙醚是非極性化合物，能與樣品脂類化合物互溶，從而除去樣品中的脂類物質(zhì)，減少基質(zhì)對后期儀器檢測的影響。第2步衍生是先將硝基呋喃類藥物的4種代謝物從其結(jié)合的蛋白質(zhì)中提取出來，再進(jìn)行衍生反應(yīng)。代謝物質(zhì)解離水解需要適當(dāng)酸性的pH值條件，故而需要鹽酸調(diào)節(jié)pH值至所需條件，同時(shí)為了之后的儀器分析，要對代謝物進(jìn)行衍生。第3步提取是將衍生后的物質(zhì)從樣品中提取出來，使用液液萃取的方法進(jìn)行提取凈化，利用衍生物質(zhì)與樣品中其他物質(zhì)在乙酸乙酯中的溶解度不同，從而達(dá)到提取凈化的目的。然后用氮吹儀氮吹，對提取液進(jìn)行濃縮以減少基質(zhì)效應(yīng)。

硝基呋喃類藥物見光易分解，故而前處理過程中盡量避光操作。

5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限、定量限

由上述4種代謝物標(biāo)準(zhǔn)曲線分析可得4種硝基呋喃類藥物代謝物的標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.5～10.0 ng/mL的范圍內(nèi)所得到的線性關(guān)系，回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的r2在 0.999 478～0.999 679范圍內(nèi)，r2>0.999 9，線性良好。即樣品濃度在0.5～10.0 ng/mL 的范圍內(nèi)，色譜峰面積與樣品中某組分的濃度成正比，可以根據(jù)線性方程進(jìn)行定量分析。本方法所用儀器達(dá)到檢出限0.25 μg/kg，定量限0.5 μg/kg。

5.3 回收率與精密度

由表5可知，豬肉空白樣品中硝基呋喃四中代謝物的3個(gè)不同添加水平，測定6次的回收率，準(zhǔn)確度范圍在 93.2%～106.1%之間，絕對誤差范圍在1.12%～6.80%之間，說明儀器所導(dǎo)致的系統(tǒng)誤差較小，處在檢測的標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)，符合檢測標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的誤差大小。由表5可知，各代謝物回收率相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為0.83%～13.90%，均<20%，即精密度較高。上述檢測數(shù)據(jù)的RSD均符合國家標(biāo)準(zhǔn)檢測要求。

5.4 檢測方法

高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法能充分利用了色譜與質(zhì)譜的檢測功能，本次試驗(yàn)中所用的液質(zhì)聯(lián)用儀是液相色譜-三級四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，其采用多級質(zhì)譜檢測，對化合物的鑒別非常精細(xì)，其檢測限能夠達(dá)到0.25 μg/kg，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于酶聯(lián)免疫法和液相色譜-紫外法兩種檢測儀器，在實(shí)際的食品檢測分析中能夠更加準(zhǔn)確的進(jìn)行藥物殘留鑒定。

6 結(jié)論

世界各國都要求禁止使用硝基呋喃類藥物于動(dòng)物源性食品當(dāng)中，該類藥物的有效檢測是對人類食用安全健康肉類食品的保證。硝基呋喃類藥物殘留量的檢測屬于痕量檢測，對于檢測方法的準(zhǔn)確性要求很高。本研究采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對豬肉中的4種硝基呋喃類代謝物殘留同時(shí)進(jìn)行檢測，得到硝基呋喃類藥物代謝衍生物的定性定量分析結(jié)果。使用4種代謝物的同位素內(nèi)標(biāo)，減少了樣品前處理對檢測結(jié)果的影響，使定量更加精確。此法前處理過程簡單易做、試驗(yàn)重復(fù)性好，該方法具有較高的靈敏度，檢測更為準(zhǔn)確且具有較低的檢出限。因此，對比液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、液相色譜-質(zhì)譜法和液相色譜法，三者中液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的準(zhǔn)確性最高，其檢測限定量限都是最低的，是三者中最為理想的檢測方法。