鄭瑞珠， 羅楊志， 張生元，， 喻運(yùn)珍，， 張立強(qiáng)， 艾桃山，

(1.武漢中博水產(chǎn)生物技術(shù)有限公司，湖北武漢 430070； 2.武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院水產(chǎn)科學(xué)研究所，湖北武漢 430207)

指環(huán)蟲是一類引發(fā)魚類寄生蟲疾病的重要病原[1]，指環(huán)蟲種類繁多，主要寄生于魚鰓部，對魚的致病力有較大的種屬差異性[2]。中型指環(huán)蟲(Dactylogyrusintermedius)是寄生于鯽(Carassiusauratus)、鯉(Cyprinuscarpio)鰓部一種較常見的指環(huán)蟲，國內(nèi)外均有報道，該蟲的寄生不僅會破壞鰓的完整性[3]、刺激黏液分泌亢進(jìn)、引起鰓絲黏連及壞死，導(dǎo)致魚類呼吸加速[4-6]，還能和其他種屬的寄生蟲共同侵染同一宿主的魚并引起致病細(xì)菌和真菌的繼發(fā)性感染，造成魚類“爛腮病”臨床癥狀，引起養(yǎng)殖魚類大量死亡[2]。

指環(huán)蟲的驅(qū)蟲藥主要有甲苯咪唑、吡喹酮、阿維菌素、辛硫磷等，由于這些藥物長期大規(guī)模地使用，導(dǎo)致指環(huán)蟲產(chǎn)生了不同程度的抗藥性，新藥研制已迫在眉睫。而目前，指環(huán)蟲驅(qū)蟲藥物的篩選主要通過觀察魚鰓上指環(huán)蟲數(shù)量的方法[7-12]，但因指環(huán)蟲的感染、發(fā)育受環(huán)境影響較大[13]，且指環(huán)蟲必須寄生在魚鰓或幼魚鰭條上[2]，離體無法長期存活，這些因素極大地限制了該方法的實用性，因此合適的指環(huán)蟲體外培養(yǎng)模型對指環(huán)蟲的研究及其防治技術(shù)研究具有重要的應(yīng)用價值和意義。目前，還沒有指環(huán)蟲體外培養(yǎng)的研究報道，本試驗將以金魚(Carassiusauratus)鰓部的中型指環(huán)蟲為研究對象，從培養(yǎng)液、抗生素及寄生載體3方面摸索中型指環(huán)蟲體外培養(yǎng)條件，研究其在體外培養(yǎng)的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗魚 本試驗金魚均購自于湖北省武漢市武昌區(qū)八一路花鳥市場，養(yǎng)在武漢市農(nóng)科院水產(chǎn)所山南魚池，試驗前均養(yǎng)在盛有24 h曝氣的自來水中。

1.1.2 細(xì)胞 本試驗所用鯉魚上皮瘤細(xì)胞(epithelima popuasum cuprini，EPC)為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院贈予。

1.1.3 培養(yǎng)基和主要試劑 M199培養(yǎng)基(1×，withL-glutamine & 15 mmol/L HEPES)，購于HyClone公司；胎牛血清(FBS)和細(xì)胞胰酶消化液(1×，0.25% Trypsin-EDTA)，購于Gibco公司；其他化學(xué)試劑，均購于進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

細(xì)胞培養(yǎng)液：將M199細(xì)胞培養(yǎng)基與胎牛血清按9 ∶1(體積比)混勻，然后加入1‰抗生素氨芐青霉素和鏈霉素，青霉素工作濃度為100 U/mL，鏈霉素的工作濃度為100 μg/mL。

稀釋液：無菌條件下，細(xì)胞培養(yǎng)液用滅菌的生理鹽水(兩棲類動物生理鹽水為0.65%的NaCl溶液)稀釋。

1.1.4 試驗儀器 細(xì)胞培養(yǎng)皿、24孔板，均購于NEST公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶，購于NUNC公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱，購于Thermo公司；解剖鏡SMZ745T，購于Nikon公司，數(shù)碼倒置顯微鏡Dsz2000x，購于重慶留輝科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 EPC細(xì)胞培養(yǎng) 無菌條件下，將經(jīng)傳代培養(yǎng)的EPC細(xì)胞重懸于細(xì)胞培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×106個/mL，取1 mL接種于24孔板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度25 ℃，通氣5% CO2。待細(xì)胞貼壁形成單層細(xì)胞后，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用生理鹽水洗2遍，加入1.5 mL稀釋液，備用。

1.2.2 中型指環(huán)蟲的收集 用MS-222將金魚麻醉后，超凈工作臺下用75%乙醇擦拭魚體表面，取下鰓片用無菌水輕柔地漂洗2次，放在盛有少量無菌生理鹽水的培養(yǎng)皿中，在解剖鏡下將中型指環(huán)蟲成蟲從魚鰓上剝離。

1.2.3 中型指環(huán)蟲體外培養(yǎng)液摸索

1.2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)液對中型指環(huán)蟲的影響 取25個從魚鰓剝離的指環(huán)蟲，分為5 組，每組5 個指環(huán)蟲，置于等倍稀釋(2倍)不含抗生素的稀釋液中培養(yǎng)，溫度為25 ℃，每隔24 h顯微鏡下觀察1次。

1.2.3.2 抗生素對中型指環(huán)蟲的影響 取55 個從魚鰓剝離的指環(huán)蟲，分為11 組，每組5 個指環(huán)蟲，置于抗生素濃度逐步稀釋的細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)，溫度25 ℃，每隔24 h顯微鏡下觀察1次，其中，抗生素的工作濃度為100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 鏈霉素為1×。

1.2.3.3 中型指環(huán)蟲的培養(yǎng)液摸索 取55 個從魚鰓剝離的指環(huán)蟲，分為11組，每組5個指環(huán)蟲，置于逐步稀釋的稀釋液中培養(yǎng)，溫度為25 ℃，每隔24 h顯微鏡下觀察1次。

1.2.4 中型指環(huán)蟲與EPC細(xì)胞共培養(yǎng) 將“1.2.2”節(jié)中剝離的蟲體轉(zhuǎn)至“1.2.1”節(jié)中24孔板于細(xì)胞培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)，溫度25 ℃，每24 h于倒置顯微鏡下觀察1次。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)液對中型指環(huán)蟲的影響

由表1可知，細(xì)胞培養(yǎng)液(無抗生素)稀釋后雖然可以延緩細(xì)菌繁殖速度，但最終還是無法控制，仍需添加抗生素；推測高濃度的細(xì)胞培養(yǎng)液可能不適合指環(huán)蟲的生長。

表1 細(xì)胞培養(yǎng)液(無抗生素)對中型指環(huán)蟲的影響

2.2 抗生素對中型指環(huán)蟲的影響

由表2可知，未經(jīng)生理鹽水稀釋的細(xì)胞培養(yǎng)液(無論是否添加抗生素)對中型指環(huán)蟲的生存均有傷害；抗生素濃度在0.3×～1.0×?xí)r，均有較好的抑菌效果。

表2 抗生素濃度對指環(huán)蟲的影響

2.3 中型指環(huán)蟲的培養(yǎng)液摸索

由表3可知，體外培養(yǎng)條件適宜的為試驗第6、7組，但考慮到高濃度抗生素和高濃度細(xì)胞培養(yǎng)液對中型指環(huán)蟲的不利影響，故選擇第6組為之后中型指環(huán)蟲體外培養(yǎng)的培養(yǎng)液(細(xì)胞培養(yǎng)液與生理鹽水體積比為5∶5，抗生素工作濃度為50 U/mL青霉素及50 μg/mL鏈霉素)。

表3 不同濃度稀釋液對中型指環(huán)蟲的影響

2.4 中型指環(huán)蟲與EPC細(xì)胞共培養(yǎng)

“2.3”節(jié)中，與生理鹽水相比，中型指環(huán)蟲可以在稀釋液中存活2 d，但仍時間不夠長，推測中型指環(huán)蟲離體培養(yǎng)的難點不僅是營養(yǎng)因素，還存在缺乏寄生載體的原因。

為了模擬魚鰓表面，選擇培養(yǎng)至形成單層細(xì)胞的鯉魚上皮細(xì)胞(EPC)作為寄生載體，設(shè)計以下試驗：取30 個從魚鰓剝離的中型指環(huán)蟲，分為6 組，包括4 個對照組和2 個試驗組，每組5 個指環(huán)蟲，25 ℃培養(yǎng)，每隔24 h于顯微鏡下觀察中型指環(huán)蟲的狀態(tài)。由表4可知，比較對照組1、2，發(fā)現(xiàn)在沒有EPC細(xì)胞作為寄生載體時，即便培養(yǎng)體系中添加培養(yǎng)液，5% CO2仍會造成指環(huán)蟲的死亡；比較對照組3、4，發(fā)現(xiàn)在有或無5% CO2下，培養(yǎng)液可長期維持EPC細(xì)胞的形態(tài)不變；對比試驗組1、2，發(fā)現(xiàn)中型指環(huán)蟲可以黏附在EPC細(xì)胞上，EPC細(xì)胞可作為中型指環(huán)蟲體外培養(yǎng)的寄生載體，并且在無5% CO2環(huán)境下的EPC細(xì)胞上附著存活更長時間。此外，圖1為光鏡下中型指環(huán)蟲與EPC細(xì)胞體外共培養(yǎng)的形態(tài)觀察圖，80倍目鏡下拍攝，圖2為光鏡下中型指環(huán)蟲體外作尺蠖運(yùn)動的形態(tài)觀察截圖，80倍目鏡下拍攝，圖2-A～圖2-L分別為光鏡下中型指環(huán)蟲體外作尺蠖運(yùn)動0～11 s時形態(tài)觀察截圖。

3 討論

指環(huán)蟲為卵生單性世代吸蟲，結(jié)合前期研究者對單殖吸蟲的生活史(除少數(shù)寄生在海水魚體上的單殖吸蟲具有中間宿主外，其他單殖吸蟲生活史只有1個宿主)及食性研究(食物為上皮細(xì)胞、腺體分泌物、血液中的1種或幾種)[14]，參考人類日本血吸蟲的體外培養(yǎng)方法[15]，選擇鯉魚上皮瘤細(xì)胞作為寄生載體，符合上皮細(xì)胞特性，且該細(xì)胞培養(yǎng)溫度與指環(huán)蟲最適生存溫度一致。M199培養(yǎng)基是培養(yǎng)鯉魚上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基，富含各種營養(yǎng)成分，并且試驗過程發(fā)現(xiàn)，相同試驗條件下，M199培養(yǎng)基的稀釋液比RPMI1640培養(yǎng)基稀釋液培養(yǎng)出的中型指環(huán)蟲活力更強(qiáng)。本研究在體外模擬指環(huán)蟲在魚鰓上寄生形態(tài)，成功構(gòu)建了中型指環(huán)蟲體外培養(yǎng)的方法及模型，并能讓中型指環(huán)蟲成蟲在體外存活6 d以上。

表4 EPC細(xì)胞對中型指環(huán)蟲的影響

注：√表示在培養(yǎng)體系中含有該物質(zhì)；×表示在培養(yǎng)體系中缺乏該物質(zhì)。

本研究在體外中型指環(huán)蟲與EPC細(xì)胞的共培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，中型指環(huán)蟲在無5% CO2環(huán)境下，寄生在EPC細(xì)胞上的存活時間更長，推測這與指環(huán)蟲在魚鰓表面寄生而非體內(nèi)寄生有關(guān)，推測指環(huán)蟲對氧氣濃度有需求，與指環(huán)蟲耐低氧性較差[16-17]一致。

中型指環(huán)蟲和壞鰓指環(huán)蟲是寄生在金魚魚鰓上的2種寄生蟲，根據(jù)相同的方法在體外進(jìn)行壞鰓指環(huán)蟲與EPC細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與中型指環(huán)蟲相比，壞鰓指環(huán)蟲較難附著在EPC細(xì)胞上，并且存活時間短于中型指環(huán)蟲，推測可能與指環(huán)蟲對宿主有較強(qiáng)的特異性有關(guān)[18]。

本研究在中型指環(huán)蟲與EPC細(xì)胞的共培養(yǎng)過程中，觀察到在EPC細(xì)胞上附著的中型指環(huán)蟲雖然具有很好的活性，但很少或幾乎不排卵，并保持成蟲形態(tài)直至死亡，這種現(xiàn)象與人體血吸蟲體外培養(yǎng)產(chǎn)卵數(shù)量少且均為不正常卵的結(jié)果[19]類似?，F(xiàn)有研究結(jié)果表明，人工干擾或不利的環(huán)境條件通常會導(dǎo)致單殖吸蟲蟲體集中大量產(chǎn)卵[20]，并且離體條件下的產(chǎn)卵速率通常與在體條件下的不同[14]，推測本研究的體外培養(yǎng)方法雖為中型指環(huán)蟲的生存提供比較好的營養(yǎng)條件及生存環(huán)境，但不能滿足中型指環(huán)蟲生殖的生理需求，因而中型指環(huán)蟲產(chǎn)卵少或不產(chǎn)卵。

該方法的建立解決了指環(huán)蟲必須寄生在魚鰓或幼魚鰭條上[2]，無法離體長期存活的問題。如果可以在體外培養(yǎng)指環(huán)蟲1個世代周期，不僅有利于克服指環(huán)蟲研究采樣難的限制，還能縮短指環(huán)蟲驅(qū)殺藥物創(chuàng)制研究的周期。