陳 陽， 秦立志， 趙博昊， 胡帥帥， 穆 琳， 翁巧琴， 鮑國連， 吳信生

(1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009； 2.浙江省余姚市欣農(nóng)兔業(yè)有限公司，浙江余姚 315400；3.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，浙江杭州 310021)

獺兔，即力克斯兔(Rex rabbit)，是皮用型兔的代表之一，其被毛顏色豐富多樣，且純天然的被毛不掉色或褪色，深受消費(fèi)者青睞。目前，美國認(rèn)可的獺兔毛色有14種，歐洲認(rèn)可的有30種，我國以青紫藍(lán)色、黑色、海貍色、白色為主。一般而言，動(dòng)物的毛色與皮膚中黑色素的數(shù)量和分布密切相關(guān)，同時(shí)許多內(nèi)在因子也影響著毛色性狀的表現(xiàn)[1]。哺乳動(dòng)物毛色主要取決于黑色素沉積，黑色素細(xì)胞產(chǎn)生真黑素和棕黑素，二者分布的不同致使哺乳動(dòng)物形成多種毛色類型[2-3]。筆者所在課題組前期利用表達(dá)譜芯片篩選與獺兔毛色形成相關(guān)的基因，發(fā)現(xiàn)CREB1基因在不同毛色的獺兔皮膚中表達(dá)差異顯著，表明該基因可能參與到獺兔的毛色形成過程中[4]。

環(huán)腺苷酸反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP responsive element binding protein，CREB)屬于DNA蛋白結(jié)合類亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子超家族，主要與cAMP等信號發(fā)生應(yīng)答反應(yīng)[5]。由于mRNA具有穩(wěn)定性調(diào)節(jié)和翻譯后修飾的調(diào)控作用，機(jī)體細(xì)胞內(nèi)存在多種CREB基因的剪接方式，可以產(chǎn)生不同的剪接體，CREB1即為該家族中常見成員之一[6-7]。已有文獻(xiàn)報(bào)道，磷酸化CREB可以激活下游轉(zhuǎn)錄因子MITF，已知MITF是主控調(diào)節(jié)黑素細(xì)胞的發(fā)展、功能和生存的基因，可激活酪氨酸酶基因的轉(zhuǎn)錄[8-10]?；诖耍狙芯客ㄟ^分子克隆等技術(shù)手段，獲得了獺兔CREB1基因的編碼區(qū)序列(coding sequence，CDS)，并利用熒光定量手段檢測其在不同獺兔皮膚中的表達(dá)規(guī)律，為進(jìn)一步探究CREB1基因的功能及毛色形成機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 選取成年青紫藍(lán)色獺兔、白色獺兔和黑色獺兔各3只，耳緣靜脈注射空氣處死，取約1 cm2相同位置的背部皮膚組織，-70 ℃保存。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 Gel Extraction Kit、DNA marker、dNTPs、TaqDNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ、BamHⅠ、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α、pMD19-T Simple Vector購于寶生物工程(大連)有限公司；Trizol試劑、質(zhì)粒提取試劑盒、SYBR?Green Master Mix試劑盒購于天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取與檢測 采用Trizol法提取總RNA，通過1%變性瓊脂糖凝膠和NanoDrop 2000核酸蛋白測定儀，檢測總RNA的完整性、濃度和D260 nm/D280 nm。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中提供的CREB1基因CDS序列(XM_002712603)設(shè)計(jì)特異性克隆引物，并分別在上下游引物中引入Hind Ⅲ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)，同時(shí)設(shè)計(jì)兔CREB1、GAPDH基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。

1.2.3CREB1基因的克隆 將總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，利用CREB1基因特異性引物擴(kuò)增編碼區(qū)序列。50 μL PCR反應(yīng)體系：ddH2O 33.5 μL，10×buffer 5 μL，dNTP 5 μL，正向引物2 μL，反向引物2 μL，模版2 μL，TaqDNA聚合酶0.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性35 s，60 ℃退火35 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。構(gòu)建pMD19-T-CREB1克隆質(zhì)粒，用Hind Ⅲ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，選取陽性質(zhì)粒送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

表1 CREB1基因克隆引物序列

注：限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)即序列中下劃線的部分。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 進(jìn)行氨基酸序列同源性比對，利用軟件MEGA 5.1構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；蛋白質(zhì)組成及疏水性分析：http：//cn.expasy.org/tools/protparam.html/；蛋白質(zhì)信號肽預(yù)測：http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/；蛋白質(zhì)跨膜區(qū)預(yù)測：http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/；蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位分析：http：//psort.hgc.jp/form2.html/；用Hopfield神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測CREB1蛋白的二級結(jié)構(gòu)(http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)；用swiss-model(http：//swissmodel.expasy.org/workspace/index.php)預(yù)測CREB1蛋白的三級結(jié)構(gòu)。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 根據(jù)熒光定量試劑盒說明書，分別對青紫藍(lán)色、白色和黑色獺兔總RNA通過反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，進(jìn)行qRT-PCR試驗(yàn)。20 μL反應(yīng)體系：AceQTMqPCR SYBR?Green Master Mix 10 μL，正向引物0.4 μL，反向引物0.4 μL，ROX Reference Dye 2 0.4 μL，DNA模板2.0 μL，滅菌蒸餾水6.8 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性 10 s，60 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)。融解曲線：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。以白色獺兔為對照組，以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參基因，采用2-ΔΔCT法計(jì)算CREB1基因的相對表達(dá)量，利用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 獺兔CREB1基因編碼區(qū)的克隆

利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測獺兔背部皮膚總RNA，顯示28S、18S和5S 3條帶，說明RNA完整性較好。用NanoDrop 2000檢測發(fā)現(xiàn)，總RNA無DNA和蛋白質(zhì)污染，符合RT-PCR要求。利用CREB1基因特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，其產(chǎn)物大小與預(yù)期(984 bp)相符，且條帶清晰、特異性好(圖1-A)。

利用TA克隆原理，將CREB1基因連接至pMD19-T Simple載體上，獲得克隆質(zhì)粒pMD19-T-CREB1，并采用限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果顯示大小約2 600、1 000 bp的2條帶(圖1-B)，與預(yù)期結(jié)果(2 692、984 bp)相符，說明CREB1基因克隆成功。

2.2 獺兔CREB1基因的序列分析

經(jīng)比對，克隆序列與NCBI(美國國立生物技術(shù)信息中心)已知序列相似度為99.6%，將克隆序列提交至GenBank(登錄號為KJ139984)。CREB1基因CDS含984個(gè)核苷酸(51.63% A+T，48.37% C+G)，共編碼327個(gè)氨基酸，相對分子量約為35.05 ku。利用ExPASy中的工具ProtParam分析得出，CREB1蛋白等電點(diǎn)為5.30，不穩(wěn)定性系數(shù)為61.13，為不穩(wěn)定性蛋白；CREB1蛋白預(yù)測GRAVY值為-0.443，為親水蛋白。通過SignalP 4.0和TMHMM預(yù)測發(fā)現(xiàn)，該蛋白無信號肽、無跨膜區(qū)，亞細(xì)胞預(yù)測顯示該蛋白主要定位于細(xì)胞核(表2)，推測該蛋白為核內(nèi)可溶性蛋白。

用Hopfield神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和Swiss-model分別對CREB1蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。結(jié)果如圖2所示，CREB1蛋白二級結(jié)構(gòu)中含有33.33%α螺旋(h)，44.95%無規(guī)卷曲(c)，21.71%延伸鏈(e)；三級結(jié)構(gòu)為1條螺旋鏈。

表2 CREB1蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位分析

2.3 獺兔CREB1蛋白與其他物種的同源性比較及系統(tǒng)進(jìn)化分析

將克隆測序得到的獺兔CREB1基因CDS與人(Homosapiens)、牛(BosTaurus)、豬(Susscrofa)、雞(Gallusgallus)、小鼠(Musmusculus)、獼猴(Macacamulatta)、猩猩(Pongoabelii)、大鼠(Rattusnorvegicus)、斑胸草雀(Taeniopygiaguttata)、非洲爪蟾(Xenopuslaevis)進(jìn)行同源性比較發(fā)現(xiàn)，獺兔CREB1基因氨基酸序列與人、豬等哺乳動(dòng)物的同源性較高，為92.9%～95.4%，而與其他非哺乳動(dòng)物(雞、斑胸草雀等)的同源性較低。利用MEGA 5.1軟件構(gòu)建鄰接法(NJ)系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)兔與人、猩猩、獼猴聚為1支，系統(tǒng)進(jìn)化情況基本上與其親緣關(guān)系遠(yuǎn)近一致，結(jié)果如圖3所示。

2.4 CREB1基因在不同毛色獺兔皮膚中的表達(dá)分析

通過qRT-PCR檢測黑色、白色和青紫藍(lán)色獺兔皮膚組織中CREB1基因mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CREB1基因在黑色獺兔和青紫藍(lán)色獺兔中的表達(dá)量均極顯著高于白色獺兔(P<0.01)，且在黑色獺兔中的表達(dá)量最高(圖4)。

3 討論

cAMP反應(yīng)元件(cAMP response element，CRE)是指基因啟動(dòng)子中的一段特定的DNA序列5′-TGACGTCA-3′[11]。CREB(環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白)是PKA(蛋白激酶A)、MAPK(絲裂原激活的蛋白激酶)、PKC(蛋白激酶C)、CaMKs(鈣調(diào)蛋白激酶)等多種蛋白激酶的磷酸化底物，這些蛋白激酶可將CREB蛋白KID(激酶誘導(dǎo)區(qū))的Ser(絲氨酸)-133位點(diǎn)磷酸化，從而影響CREB的活性[12-15]。已知，cAMP-PKA信號通路介導(dǎo)的磷酸化反應(yīng)在黑色素生成過程中發(fā)揮了重要作用，CREB則是活化的PKA的主要靶標(biāo)蛋白，磷酸化后CREB激活MITF的轉(zhuǎn)錄，促使MITF與TYR基因啟動(dòng)子Mbox結(jié)合，從而激活TYR的表達(dá)，促進(jìn)黑色素生成。反之，降低CREB的磷酸化水平，MITF和酪氨酸酶也會受到一定的抑制[16]。在筆者所在課題組前期研究中，通過高通量技術(shù)手段發(fā)現(xiàn)CREB1基因與獺兔的毛色形成有關(guān)，與已有報(bào)道相符。

在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)獺兔CREB1基因的氨基酸序列與NCBI中其他哺乳動(dòng)物具有很高的同源性，即CREB1基因在哺乳動(dòng)物中非常保守，那么CREB1基因在獺兔毛色形成中是否具有同樣的功能呢？已有報(bào)道指出，CREB1基因可調(diào)控MC1R基因與MITF基因之間色素沉著信號的傳遞，進(jìn)而影響黑色素的沉積[17]。通過對黑色素生成信號通路的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，MC1R對CREB1有激活作用，增強(qiáng)MITF基因的表達(dá)，活化了與黑色素形成密切相關(guān)的基因，如TYR、TYRP1和KIT，所以CREB1在黑色皮膚中的表達(dá)量較高[18]。本研究中獺兔CREB1基因在黑色獺兔和青紫藍(lán)色獺兔皮膚中表達(dá)水平高于白色獺兔，也印證了其他學(xué)者的觀點(diǎn)，CREB1基因?qū)谏氐男纬捎忻黠@的促進(jìn)作用。

本研究利用分子克隆手段獲得獺兔CREB1基因的編碼區(qū)序列，通過生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，該蛋白為無信號肽、無跨膜區(qū)的核內(nèi)可溶性蛋白，且在哺乳動(dòng)物中非常保守。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，CREB1基因的表達(dá)量與毛色的黑色素沉積存在一定的關(guān)聯(lián)性，本研究為探索獺兔毛色形成機(jī)制提供了一定的基礎(chǔ)資料。