劉西梅， 任紅艷， 華再東， 肖紅衛(wèi)， 李 莉， 張立蘋， 程 妮， 畢延震

(湖北省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所/動物胚胎及分子育種湖北省重點實驗室，湖北武漢 430064)

體內(nèi)卵是一種特殊資源，從取卵時間、位置及動物生長發(fā)育階段分析，取到成熟優(yōu)質(zhì)的卵是一項耗時、費力、高成本的工作[1-3]。但高質(zhì)量的體內(nèi)成熟卵對于體外受精、單精子注射、體細胞克隆、卵子發(fā)育研究和應用都是無法有效替代的良好的原始材料[4-6]。單胎生物如牛、人等一次性排卵持續(xù)短，取卵時間、地點(位置)易于掌握[7-9]，收卵效率也非常高；而多胎動物豬排卵持續(xù)時間長，如不采取人為干預措施，卵的回收效率非常低，而且獲得的卵質(zhì)量參差不齊，動物及卵的利用率非常低[10-11]。本研究利用后備豬，從不同時間、位置采集卵母細胞，以研究定時、定點采卵方法，提高豬體內(nèi)卵母細胞的收獲率。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗動物為后備湖北白豬(母)，體質(zhì)量約100 kg[12]。

試劑耗材：人絨毛膜促性腺激素(HCG)、孕馬血清促性腺激素(PMSG)，均購自寧波激素二廠；收集卵所用溶液為DPBS，購自GIBCO公司[13]。

1.2 試驗設計

以不同劑量HCG處理，在不同時間取卵(從輸卵管中)，由此篩選出最有效的取卵時間，并以此時間為基準，研究不同劑量處理在輸卵管和卵巢中取卵的效果。

1.3 方法

1.3.1 超排處理 主要用PMSG處理，具體劑量、方法等參考魏慶信等的操作程序[12]。

1.3.2 取卵 試驗所有取卵均采用手術取卵，取卵溶液DPBS，取卵位置分卵巢和輸卵管2個地點，具體操作過程及程序等均參照文獻[1-2]；值得注意的是用10 mL注射器接16號及以上型號的針頭在卵巢中抽卵最為有效[14-16]。

1.3.3 卵的計數(shù)及鑒別 收集的含卵溶液在實體顯微鏡下仔細挑取所有卵，然后在倒置顯微鏡上一一鑒別卵的質(zhì)量分別為未成熟、成熟、老化、裂解[13，17]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)應用SPSS 17.0軟件統(tǒng)計和SNK多重比較法分析和差異顯著性比較[18]。結果以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 輸卵管取卵時間

試驗豬自然發(fā)情開始時，用相應劑量的HCG處理，以 12 h 間隔分組，在輸卵管沖卵，收集成熟的卵母細胞，各組收卵率見表1。由表1可知，使用HCG的劑量500～1 500 IU，注射后 12 h 在輸卵管中沖卵收獲率均很低，每頭豬只能獲得0.17～0.23枚，且注射HCG劑量影響不明顯，但劑量有提高收率的趨勢；24 h取卵時，500 IU組明顯低于其他2組(1 000 IU、1 500 IU)；同樣500 IU組，24 h獲得卵率也低于其后時間組(36～72 h)，36 h及以后時間組之間變化不明顯，但從36 h開始有老化卵現(xiàn)象(退化卵)。由此可見，發(fā)情開始注射 1 000 IU HCG，24 h后輸卵管取卵是最佳時間，且可以獲得最佳取卵效果。

2.2 不同劑量HCG對不同位置取卵數(shù)量的影響

豬自然發(fā)情開始，用不同劑量HCG處理24 h，分別在輸卵管和卵巢中取卵，收獲卵的數(shù)量見表2。由表2可知，隨著HCG使用量增加，輸卵管收集卵也越多。其中，1 000 IU及以上劑量組之間差異不明顯，但均顯著高于0、200、500 IU組(P<0.05)，且這3組之間差異明顯。相反在卵巢中取卵，HCG使用劑量越小，取卵越多，而且 1 000 IU 及以上劑量組之間差異不明顯，但都顯著低于 1 000 IU 以下劑量組(P<0.05)，并且0、200、500 IU單位之間差異顯著(P<0.05)。然而，卵巢與輸卵管收集卵平均數(shù)之和均在12.21～14.28之間，與湖北白豬正常排卵數(shù)[1]相一致。從獲卵數(shù)量和質(zhì)量綜合分析，發(fā)現(xiàn)1 000 IU組輸卵管取卵、200 IU組卵巢取卵收獲率高，殘次率低，是一個最有效的收卵時機。

2.3 超排處理對取卵數(shù)量的影響

正常發(fā)情周期內(nèi)，距上次發(fā)情16～17 d，按1 000 IU/頭劑量肌肉注射PMSG[5]，出現(xiàn)發(fā)情癥狀時注射HCG，再過24 h取卵，結果見表3。

表1 自然發(fā)情豬注射HCG后取卵時間

注：數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

表2 自然發(fā)情使用不同劑量HCG后取卵位置與數(shù)量變化

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，表3同。

由表3可知，超排處理后，隨HCG劑量增加，輸卵管(自然排卵)中收集的卵數(shù)量依次增加，0、200、500 IU各劑量段顯著增加(P<0.05)，1 000 IU以上增加不明顯，而從卵巢中抽卵數(shù)依次減少，且低劑量時(0、200、500 IU)顯著減少(P<0.05)，1 000 IU以上減少不明顯。但各劑量組間，輸卵管收集卵與卵巢抽卵獲卵數(shù)均值合計在21.17～22.96，變化不明顯。但比較表2和表3，發(fā)現(xiàn)自然發(fā)情獲卵均值合計為 12.21～14.28枚，比超排的21.17～22.96枚少獲卵8.99枚，這說明超排能獲得更多的卵，這提示超排處理盡管可以排出大量卵，但豬的子宮內(nèi)著床胚胎的數(shù)量有限，產(chǎn)仔數(shù)無限增加不合邏輯，所以生產(chǎn)中豬不宜超排。當然，如果僅為獲得卵或早期胚胎，超排還是有效的，而且1 000 IU HCG可以起到理想效果，但超排后發(fā)育的卵雖然較多，但部分卵發(fā)育不同步或發(fā)育不全，會致其未成熟。

表3 超排處理豬注射不同劑量HCG后取卵數(shù)量比較

3 結論與討論

試驗研究及生產(chǎn)中渴望有大量的優(yōu)質(zhì)體內(nèi)卵，無論是自然發(fā)情，還是超排處理，都會有所收獲，但最大限度地利用供體豬生產(chǎn)卵才是需求者不斷追求的目標，特別是同步化優(yōu)質(zhì)的卵[19-21]，這其中除了使用合適劑量排卵激素(HCG)外，定時、定點取卵也非常關鍵。理論上應該在排卵前2～3 h從卵巢中取卵、排卵后1～2 h內(nèi)在輸卵管中取卵，這對單胎動物不是難事[9]，而多胎動物豬在自然狀態(tài)下很難做到，這就需要使用合適劑量的排卵激素處理，在合適的位置、合適的時間收集卵[22-23]，本研究結果，在1 000 IU 24 h于輸卵管取卵或200 IU 24 h于卵巢取卵，收獲的成熟卵最多，可達到理想狀態(tài)，即實現(xiàn)定時、定點取卵可以在后備豬取得良好效果。