禹海鑫， 蔡 波， 孫民琴， 郭驍駒， 楊曉軍， 安榆林

(1.南通出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇南通 226004； 2.海南出入境檢驗(yàn)檢疫局熱帶植物隔離檢疫中心，海南海口 570311；3.江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局動植物與食品檢測中心，江蘇南京 210009)

溝脛天牛亞科(Laniinae)隸屬于鞘翅目(Cleoptera)葉甲總科(Chrysomiloidea)天?？?Cerambycidae)，是天?？浦蟹N類最多的一個(gè)亞科。其中，長角天牛屬(Acanthocinus)天牛是該亞科內(nèi)極為重要的一類林木蛀干害蟲，可危害魚鱗松、油松、馬尾松、紅松、山楊、核桃、櫟屬等多種針、闊葉樹種。該屬天牛主要以幼蟲鉆蛀樹木的木質(zhì)部、韌皮部和邊材組織為害，常使樹勢衰弱，危害嚴(yán)重時(shí)還會導(dǎo)致樹木整株死亡，給農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。截至目前，該屬昆蟲在全世界范圍內(nèi)已被描述的種類約有14種，廣泛分布于歐洲、非洲北部、俄羅斯、日本、朝鮮、中國臺灣等國家和地區(qū)。我國已報(bào)道的長角天牛屬昆蟲種類約有5種，包括白帶長角天牛(A.carinulatus)、大灰長角天牛(A.aedilis)、小灰長角天牛(A.griseus)、黑帶長角天牛(A.stillatus)和臺灣長角天牛(A.gundaiensis)[2-3]。其中，白帶長角天牛被2007年公布的《進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》列為我國進(jìn)境植物檢疫性有害生物。

近年來，隨著我國進(jìn)出口貿(mào)易的迅猛發(fā)展，原木、板材及木質(zhì)包裝的進(jìn)出口總量也與日俱增，這些貨物中極易攜帶大量天牛、小蠹等有害生物，對我國口岸生物安全造成極大威脅。我國口岸曾多次在進(jìn)境原木及木質(zhì)包裝中截獲到長角天牛屬昆蟲。例如，2013年深圳口岸檢疫人員從進(jìn)境羅馬尼亞云杉原木中截獲了檢疫性害蟲——白帶長角天牛[4]；2016年，深圳蛇口口岸檢疫人員在進(jìn)境美國長葉松中首次截獲到了結(jié)節(jié)長角天牛(A.nodosus)[5]；2016年，江蘇常州口岸檢疫人員在進(jìn)境美國白松原木中首次截獲到了斜帶長角天牛(A.oblisquus)[6]。

面對如此嚴(yán)峻的生物入侵形勢，只有對有害生物進(jìn)行快速、精確的鑒定才可以采取針對性的措施有效阻止其入侵我國。目前，各口岸主要采用傳統(tǒng)的昆蟲種類鑒定方法，即依據(jù)形態(tài)特征，同時(shí)參照昆蟲分類檢索表的方法對長角天牛屬天牛進(jìn)行分類鑒定。但在口岸檢疫過程中，由于截獲的天牛多以卵、幼蟲、蛹或肢體殘缺成蟲的蟲態(tài)出現(xiàn)，利用形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行鑒定相當(dāng)困難，很多天牛標(biāo)本就無法鑒定到種[7]。因此，迫切須要探索新的鑒定技術(shù)來彌補(bǔ)傳統(tǒng)鑒定方法的不足。截至目前，利用分子生物學(xué)手段研究物種鑒定、系統(tǒng)發(fā)育已經(jīng)成為昆蟲學(xué)科的研究熱點(diǎn)。其中，由于線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ基因(mtDNACOⅠ)結(jié)構(gòu)相對保守，且種間差異比較大，因此，利用基于COⅠ基因序列片段的DNA條形碼技術(shù)進(jìn)行近緣種間鑒定及系統(tǒng)發(fā)育的研究已經(jīng)得到了更為成熟的應(yīng)用[8]。Stauffer利用該DNA條形碼技術(shù)對歐洲7種齒小蠹進(jìn)行了快速準(zhǔn)確的鑒定[9]。禹海鑫等應(yīng)用該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了白條天牛屬下13個(gè)種類準(zhǔn)確高效的鑒定[10]。鄔穎等也通過該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了光肩星天牛幼蟲種類的快速鑒定[11]。鄭絲竹深入研究了天?？苹驐l形碼的構(gòu)建方法及分子快速鑒定技術(shù)，為探索天牛種類的分子鑒定方法提供了極有價(jià)值的參考[12]。

白帶長角天牛作為重要的檢疫性有害生物，對其及所在屬內(nèi)多個(gè)種類天牛進(jìn)行快速鑒定具有重要意義。本研究收集了5種口岸截獲的長角天牛樣本，對其COⅠ片段進(jìn)行擴(kuò)增和測序，并與GenBank中下載的9條COⅠ序列進(jìn)行比對，分析這些序列的堿基多樣性、遺傳距離和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，以期獲得1種快速鑒定長角天牛種類的分子方法，為今后農(nóng)林部門及進(jìn)出境植物檢疫部門對長角天牛屬昆蟲的快速準(zhǔn)確鑒定提供依據(jù)[13]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣本

本試驗(yàn)所用標(biāo)本由南通出入境檢驗(yàn)檢疫局有害生物檢疫實(shí)驗(yàn)室提供，包括小灰長角天牛(A.griseus)、大灰長角天牛(A.aedilis)、斜帶長角天牛、A.princeps、白帶長角天牛5種長角天牛，所有天牛標(biāo)本均由國內(nèi)天牛專家安榆林研究員鑒定復(fù)核。標(biāo)本來源與采集時(shí)間見表1。另外，從GenBank網(wǎng)站獲得小灰長角天牛、大灰長角天牛、A.reticulatus、Acanthocinussp. CA14_3.01 4種長角天牛，及作為外群的棕櫚象甲(Rhynchophoruspalmarum)的共9條COⅠ序列(表2)，用于比對分析。其中，白帶長角天牛是我國進(jìn)境植物檢疫性昆蟲，其他長角天牛均是其同屬近似種。

表1 供試標(biāo)本的來源及采集時(shí)間

表2 本研究使用的GenBank下載的COⅠ基因序列信息

1.2 樣品組織基因組DNA提取

用GenMagBio動物細(xì)胞組織/細(xì)胞基因組DNA磁珠提取試劑盒(北京金麥格生物技術(shù)有限公司)提取上述各個(gè)樣品組織的基因組DNA。提取步驟如下：剪取適當(dāng)大小的經(jīng)乙醇浸泡的各天牛樣品肌肉組織(應(yīng)少于30 mg)，用雙蒸水沖洗干凈后，裝入 1.5 mL 離心管中并置于MM400球磨儀(德國retsch公司提供)中振蕩研磨60 s(30次/s)，再將磨碎的組織離心10 min(轉(zhuǎn)速為12 000 r/min)。離心后加入180 μL裂解緩沖液及20 μL蛋白酶K，漩渦振蕩，重懸已經(jīng)預(yù)處理的組織樣品，然后放入55 ℃水浴鍋中溫浴1～3 h，直至組織樣品完全裂解消失。加200 μL無水乙醇、200 μL Binding Buffer、20 μL磁珠，磁珠用于吸附組織中的基因組DNA。加入 500 μL Wash Buffer去除雜質(zhì)后，再加入20 μL Elution Buffer，靜置10 min后洗脫磁珠，便可獲得樣品組織的基因組DNA溶液[14-15]。

1.3 COⅠ片段擴(kuò)增與測序

本試驗(yàn)PCR擴(kuò)增反應(yīng)采用巢氏PCR，在ProFlexTMPCR儀(美國ABI公司提供)上進(jìn)行。反應(yīng)采用25 μL體系，包括1.0 μL基因組DNA模板、2.0 μL MgCl2(25.0 mmol/L)、2.5 μL 10×buffer(不含Mg2+)、1.0 μL dNTPs(2.5 mmol/L)、0.4 μL rTaqDNA聚合酶(5.0 U/μL，購自TaKaRa公司)，各0.5 μL上、下游引物(10.0 μmol/L，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成)，再加滅菌水補(bǔ)至總體積為25 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，36個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。反應(yīng)完畢后將產(chǎn)物送至南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測序分析[10，12]。巢式PCR第1輪反應(yīng)引物為F-1、R-1，第2輪PCR引物為F-2、R-2[12]，各引物序列信息如表3所示。本研究采用巢式PCR，既降低了擴(kuò)增出非目的基因條帶的概率，又增強(qiáng)了該P(yáng)CR檢測的可信度和靈敏度[12]。

表3 巢式PCR所用引物序列

1.4 序列處理及分析

將各樣品COⅠ序列測序結(jié)果導(dǎo)入DNAStar中的SeqMan分析軟件中進(jìn)行拼接與手工校正[16]。利用美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，簡稱NCBI)的Blast工具進(jìn)行序列相似性搜索，以確定序列的方向和可信度。再將所測序列以及從GenBank下載的8條長角天牛序列一同載入Clustal X 1.83軟件進(jìn)行比對，輸出格式為FASTA[17]。最后將所有比對結(jié)果導(dǎo)入MEGA 5.20軟件中[18]計(jì)算各種類間的遺傳距離、轉(zhuǎn)換和顛換值及其比值(R)、變異位點(diǎn)(variable sites，簡稱V)及保守位點(diǎn)(conserved sites，簡稱C)等數(shù)值[13]，同時(shí)，利用鄰接法(neighbor-joining，簡稱NJ)，選取Kimura 2-parameter遺傳距離模型，建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA凝膠電泳結(jié)果

本試驗(yàn)對5種長角天牛共7個(gè)樣本的基因組DNA進(jìn)行COⅠ基因片段巢式PCR擴(kuò)增，由圖1的電泳結(jié)果可以看出，7個(gè)樣本在525 bp處均有清晰且特異性良好的目的條帶，可滿足后續(xù)基因測序的需要。

2.2 長角天牛COⅠ序列解析

2.2.1COⅠ基因序列組成和變異特征 將測序和下載的各條序列導(dǎo)入MEGA 5.20軟件中，剪切成同等長度片段(434 bp)[19]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，保守位點(diǎn)(C)、變異位點(diǎn)(V)、自裔位點(diǎn)(S)和簡約信息(Pi)位點(diǎn)分別有199、235、56、179個(gè)。另外，統(tǒng)計(jì)所有位點(diǎn)的堿基平均含量發(fā)現(xiàn)，A平均含量為 29.8%，T為34.1%，G為14.4%，C為21.7%[12]。其中，A、T的含量相近，且A+T含量高達(dá)63.9%，明顯高于G+C含量(36.1%)，表現(xiàn)出明顯的A+T堿基偏嗜，這也基本符合昆蟲線粒體基因堿基組成的基本規(guī)律[19-20]。

2.2.2 堿基替換規(guī)律分析 用MEGA 5. 20軟件分析序列各位點(diǎn)堿基替換規(guī)律[21]。由表4可以看出，整體位點(diǎn)的轉(zhuǎn)換主要出現(xiàn)在C與T之間，顛換則主要出現(xiàn)在T與A之間，轉(zhuǎn)換/顛換比值(R值)為0.83。對密碼子各位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)換和顛換主要在密碼子第2位點(diǎn)上發(fā)生，且轉(zhuǎn)換與顛換值相當(dāng)(R=0.74)。此外，第1、3位點(diǎn)R值分別為0.59、1.29。無論整體或是密碼子各位點(diǎn)，R值均小于2，表明該序列轉(zhuǎn)換與顛換未達(dá)到飽和，在構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹時(shí)要考慮轉(zhuǎn)換與顛換的發(fā)生概率。

表4 核甘酸堿基替換結(jié)果

注：Avg表示平均頻率，1st表示第1位點(diǎn)，2nd表示第2位點(diǎn)，3rd表示第3位點(diǎn)，ii表示相同堿基對，si表示轉(zhuǎn)換堿基對，sv表示顛換堿基對，R表示轉(zhuǎn)換堿基對/顛換基對。

2.2.3 遺傳距離分析 根據(jù)Kimure 2-parameter模型分析7種15頭長角天牛和1個(gè)外種群之間的遺傳距離，將轉(zhuǎn)換和顛換考慮在內(nèi)，利用Bootstrap值(1 000次)進(jìn)行檢驗(yàn)[21]。由表5可以看出，長角天牛屬內(nèi)相同物種內(nèi)的遺傳距離數(shù)值介于0.000～0.016內(nèi)，平均遺傳距離為0.01，其中小灰長角天牛種內(nèi)距離最小，為0～0.014；斜帶長角天牛種內(nèi)距離最大，為0.016；長角天牛屬不同種間的遺傳距離介于0.055～0.629之間，平均遺傳距離為0.350，其中相似種A.princeps與白帶長角天牛之間的遺傳距離最小，為0.055；斜帶長角天牛1與A.reticulatus之間的遺傳距離最大，為0.629。可見，同一物種內(nèi)的遺傳距離較近，基本不受其地理分布的影響；同屬不同種類間的遺傳距離較遠(yuǎn)，呈現(xiàn)出較為明顯的遺傳差異性，可考慮將此段序列作為鑒別不同物種的依據(jù)。

表5 基于Kimure 2-parameter模型長角天牛屬的種內(nèi)、種間遺傳距離

注：1表示小灰長角天牛1；2表示小灰長角天牛2；3表示大灰長角天牛1；4表示斜帶長角天牛1；5表示斜帶長角天牛2；6表示A.princeps；7表示白帶長角天牛；8表示小灰長角天牛5；9表示小灰長角天牛3；10表示小灰長角天牛4；11表示大灰長角天牛2；12表示大灰長角天牛3；13表示大灰長角天牛4；14表示A.reticulatus；15表示Acanthocinussp. CA14_3.01；16表示棕櫚象甲。

2.2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的建立 采用MEGA 5.20分析軟件，選擇棕櫚象甲為外群，以長角天牛屬7種昆蟲共15條COⅠ序列為靶標(biāo)，使用鄰接法建立系統(tǒng)發(fā)育樹。從圖2可以看出，從整體上看，長角天牛屬各近似種聚為一大支，而外群棕櫚象甲單獨(dú)成1支，此聚類結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致。在長角天牛屬所聚的一大支中，7種長角天牛又分聚為2支，其中小灰長角天牛、大灰長角天牛、A.reticulatus和Acanthocinussp. CA14_3.01聚為1支，說明這4種長角天牛的遺傳進(jìn)化關(guān)系較為接近，互為近緣種；同時(shí)，又與聚為另1支的斜帶長角天牛、A.princeps及白帶長角天牛遺傳進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，也說明彼此之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，2支互為姊妹群。從局部來看，同一種類不同個(gè)體之間各聚為一小支，且置信度很高，這樣就很容易和其他種類的長角天牛區(qū)分開來。上述結(jié)果表明，長角天牛屬不同種類之間的系統(tǒng)進(jìn)化差異明顯，因此可將此DNA條形碼用作長角天牛屬不同種類分子鑒定的依據(jù)。

3 結(jié)論與討論

一般而言，使用DNA條形碼對物種進(jìn)行快速準(zhǔn)確的鑒定須要滿足2個(gè)必要條件：首先每個(gè)物種都要具有獨(dú)特且又相對保守的DNA條形碼序列；其次是該條形碼序列種間差異必須遠(yuǎn)大于其種內(nèi)的差異[8]。本研究所采用的線粒體COⅠ基因序列就滿足上述條件。首先，地球上幾乎所有真核生物都含有線粒體COⅠ基因，且該基因含有很多相對保守的遺傳信息位點(diǎn)。其次，對7種15頭長角天?；诰€粒體COⅠ基因的種內(nèi)及種間遺傳距離進(jìn)行計(jì)算，發(fā)現(xiàn)種內(nèi)遺傳距離為0.000～0.016，平均為0.01；種間遺傳距離介于0.055～0.629之間，平均為0.35；種間遺傳距離是種內(nèi)遺傳距離的35倍，完全符合種間差異應(yīng)大于種內(nèi)差異10倍以上的物種鑒定原則。事實(shí)上，線粒體COⅠ基因常被作為DNA條形碼，用于昆蟲種類鑒定及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)的研究，類似的基因還有Cytb、18S、28S、5.8S、ITS、rbcL、matK等[22]。王穎等利用COⅠ基因作為DNA條形碼，實(shí)現(xiàn)了對山東口岸進(jìn)境原木截獲蚊蟲種類的快速鑒定[23]。董昆應(yīng)用COⅠ基因分析了蘋果蠹蛾不同地理種群間的遺傳差異，并實(shí)現(xiàn)了對其幼蟲的快速鑒定[24]。趙文靜等利用COⅠ及ITS序列作DNA條形碼深入研究了環(huán)帶庫蚊的分類地位和雜鱗庫蚊復(fù)組內(nèi)各親緣種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[25]。

目前我國口岸昆蟲種類鑒定主要依賴于完整成蟲的形態(tài)特征，而實(shí)際上口岸截獲到的多是昆蟲的卵、幼蟲、蛹及肢體殘破的成蟲。卵、幼蟲和蛹須要花費(fèi)較長時(shí)間培養(yǎng)至成蟲階段才能進(jìn)行種類鑒定，而肢體殘破的成蟲則失去了形態(tài)學(xué)鑒定的價(jià)值。用DNA條形碼技術(shù)就能很容易突破上述形態(tài)學(xué)鑒定方法遇到的瓶頸[26]。但是目前該技術(shù)[27]在長角天牛屬種類鑒定中的應(yīng)用還鮮有報(bào)道。本研究通過對5種長角天牛COⅠ基因所測序列與GenBank部分長角天牛COⅠ序列進(jìn)行比對分析，發(fā)現(xiàn)該段序列既能高效區(qū)分部分長角天牛種類，又能提供豐富的物種親緣關(guān)系信息。此外，本研究還首次對斜帶長角天牛、白帶長角天牛和A.princeps的COⅠ基因序列進(jìn)行測序，不僅補(bǔ)充了長角天牛屬COⅠ基因數(shù)據(jù)庫，還將為基于COⅠ基因快速鑒定其他種類天牛的研究提供有益參考。值得注意的是，由于本研究未收集到全部的長角天牛屬種類，僅能針對部分種類進(jìn)行分析，因此本研究采用的DNA條形碼尚不能確定可以完全鑒別所有的長角天牛種類，只能說明DNA條形碼技術(shù)[27]在長角天牛屬昆蟲分子鑒定上具有可行性。后續(xù)研究應(yīng)圍繞收集長角天牛屬其他種類，完善COⅠ基因數(shù)據(jù)庫，結(jié)合多個(gè)基因共同分析等方向努力，以期獲得更高效的DNA條形碼，進(jìn)而得到更精確的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。