劉連軍， 黎 萍， 李恒銳， 楊海霞， 農(nóng)秋連， 梁振華， 馬仙花

(廣西南亞熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，廣西崇左 532415)

朱砂葉螨[Tetranychuscinnabarinus(Boisduval)]屬葉螨科(Tetranychidae)，別稱紅蜘蛛，是危害木薯最為嚴(yán)重的一種害螨，可導(dǎo)致當(dāng)?shù)啬臼頊p產(chǎn)10%～30%，嚴(yán)重危害時(shí)可減產(chǎn) 50%～70%[1]。朱砂葉螨個(gè)體小、繁殖能力強(qiáng)、世代周期短，年繁殖代數(shù)可達(dá)15代。由于生產(chǎn)上長期大面積使用化學(xué)農(nóng)藥防治朱砂葉螨，不可避免地會產(chǎn)生抗藥性[2-3]。

阿維菌素是一種廣譜、高效、低殘留，對人畜安全的抗生素類殺蟲劑[4-5]，以干擾害蟲神經(jīng)來殺死害蟲，與常用殺蟲劑的作用機(jī)制不同，不會和常用殺蟲劑產(chǎn)生交互抗性，適合防治對其他殺螨劑已產(chǎn)生抗藥性的害蟲。用阿維菌素進(jìn)行螨類抗性選育已有報(bào)道，如陳文博等研究表明，土耳其斯坦葉螨對阿維菌素的抗性發(fā)展較慢[6]；劉貽聰?shù)妊芯康贸?，二斑葉螨田間種群普遍對阿維菌素產(chǎn)生了穩(wěn)定抗性[7]；宋麗雯等用阿維菌素對截形葉螨進(jìn)行抗性篩選，結(jié)果表明截形葉螨對阿維菌素抗性較穩(wěn)定[8]。

螨類抗藥性形成與體內(nèi)各種解毒酶系活性變化存在密切聯(lián)系[9]。研究認(rèn)為，多功能氧化酶(MFO)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)、羧酸酯酶(CarE)等是動物體內(nèi)的重要解毒酶系[10]。MFO的底物譜極廣，幾乎能氧化代謝所有殺蟲劑，與許多害蟲的抗藥性形成有關(guān)；GSTs能使內(nèi)源谷胱甘肽與化學(xué)農(nóng)藥(包括殺蟲劑、殺螨劑)中具有毒理作用的親電基團(tuán)結(jié)合并排出體外；CarE是昆蟲體內(nèi)重要的解毒酶系，在對外源化合物的解毒代謝和對殺蟲劑的抗性形成中起重要作用。何林等報(bào)道用阿維菌素處理不同螨類其結(jié)果都表明該抗性品系的形成與體內(nèi)解毒酶活性升高有一定關(guān)系[9，11-12]，但尚未見對木薯朱砂葉螨抗藥性機(jī)制方面的報(bào)道。本研究采用室內(nèi)噴藥繼代汰選法對阿維菌素進(jìn)行木薯朱砂葉螨抗性篩選，分析敏感品系和抗性品系3種解毒酶活性的變化，旨在探討朱砂葉螨對阿維菌素抗性形成及其體內(nèi)解毒酶活性變化與產(chǎn)生抗性之間的關(guān)系，為朱砂葉螨的抗性綜合治理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)和時(shí)間

試驗(yàn)地點(diǎn)設(shè)在廣西南亞熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所農(nóng)產(chǎn)品檢測中心，2016年4—12月進(jìn)行室內(nèi)抗性品系篩選，2017年1月進(jìn)行解毒酶活性測定。

1.2 供試蟲源

朱砂葉螨敏感品系(SS)：供試木薯朱砂葉螨采自廣西南亞熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所木薯種植田間，試驗(yàn)前在室內(nèi)飼養(yǎng)繁殖至少2代。飼養(yǎng)溫度為(27±2) ℃，相對濕度為(75±2)%，光照16 h/d，期間不接觸任何藥劑。

朱砂葉螨抗性品系(Ab-R)：從朱砂葉螨敏感品系中分離部分群體，擴(kuò)繁后用阿維菌素乳油進(jìn)行抗性篩選，采用水隔式飼養(yǎng)法(木薯葉葉背朝上置于托盤內(nèi)的浸濕海綿上)連續(xù)飼養(yǎng)至15代，可視為抗性品系。

1.3 供試藥劑和主要儀器

阿維菌素乳油(購自廣東中迅農(nóng)科股份有限公司)；α-萘酚(購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，分析純；固藍(lán)B鹽(購自成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司)，分析純；4-對硝基苯甲醚(購自成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司)，分析純；十二烷基磺酸鈉(SDS，購自北京欣華綠源科技有限公司)，化學(xué)純；α-乙酸萘酯(購自上海瑞永生物科技有限公司)，化學(xué)純；毒扁豆堿(a-NA，購自Fluka公司)，純度≥98%；2，4-二氯硝基苯(DCNB，購自Sigma公司)，純度>98%，化學(xué)純；還原型谷胱甘肽(購自Japan公司)，純度≥98%；牛血清白蛋白(購自北京欣華綠源科技有限公司)；考馬斯亮藍(lán)G-250(購自Fluka公司)；乙二胺四乙酸(EDTA，購自上海源葉生物科技有限公司)；還原型輔酶Ⅱ(NADPH，購自Sigma公司)，純度≥98%。人工氣候培養(yǎng)箱(型號LRH-250-GsbI，購自韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司)；T6新世紀(jì)紫外分光光度計(jì)(購自北京普析通用儀器有限公司)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 抗性品系選育 參照黎萍等的方法[13]，用1.8%阿維菌素乳油，以種群死亡率25%左右的選擇壓力給予噴藥處理，噴藥24 h后將存活的葉螨個(gè)體轉(zhuǎn)移到托盤里離體新鮮的木薯葉背面，采用水隔式培養(yǎng)，待存活個(gè)體在新鮮木薯葉上產(chǎn)卵3 d后移走，每次噴藥后進(jìn)行生物測定，計(jì)算致死中濃度，適當(dāng)提高每代噴藥濃度。當(dāng)F1代成螨高峰期時(shí)再次噴藥處理，重復(fù)上述操作，直至F15代。

1.4.2 室內(nèi)毒力測定 參照黎萍等的方法[13]，每代分別設(shè)置5種不同梯度的藥劑濃度，每個(gè)梯度濃度保證螨死亡率在40%～75%，每個(gè)濃度重復(fù)3次，用清水作為對照。取飼養(yǎng)室個(gè)體大小均勻一致的雌成螨接于新鮮離體的木薯葉背面，作為F0代成螨。用手持式噴霧器均勻噴施于木薯葉背面，24 h 后檢查死亡率，挑選存活成螨置于人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為(27±2) ℃，相對濕度為(75±2)%左右，光照 16 h/d。每次施藥后記錄施藥前成螨總數(shù)和施藥后死亡數(shù)，計(jì)算抗性指數(shù)。

抗性指數(shù)=抗性品系LC50/敏感品系LC50。

1.4.3 解毒酶活性測定

1.4.3.1 酶液制備 挑取木薯朱砂葉螨敏感品系和經(jīng)致死量處理過100頭左右的雌性朱砂葉螨，加入2 mL相對應(yīng)的磷酸緩沖液(0.1 mol/L、pH值為7.0)，冰浴中研磨充分，在高速離心機(jī)中離心(10 000 r/min、4 ℃)15 min，取上清液，置于冰浴中待用，上清液即為酶液。

1.4.3.2 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 取7支試管按表1順序加入試劑，在37 ℃恒溫水浴內(nèi)放置10 min，在595 nm下比色測定(表1)。以牛血清蛋白含量(μg/mL)為橫坐標(biāo)，并以測得的吸光度取平均值后為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線測定

1.4.3.3 CarE活性測定 參照van Asperen的方法[14]，以 a-NA (3×10-4mol/L，含10-4mol/L a-NA)為底物，加 3 mL 酶液，混勻，在30 ℃恒溫水浴10 min，立刻加0.5 mL顯色劑，在30 ℃水浴反應(yīng)10 min，待顏色穩(wěn)定后，在紫外分光光度儀上600 nm處測定吸光度，3次重復(fù)。根據(jù)酶源蛋白質(zhì)含量的測定結(jié)果計(jì)算CarE的比活力[mmol/(mg·30 min)]。

1.4.3.4 GSTs活性測定 參照Clark等的方法[15]，取 66 mmol/L pH值為7.0的磷酸緩沖液、50 mmol/L谷胱甘肽、0.03 mol/L 2，4-二硝基苯和酶液分別為2.4、0.3、0.1、0.2 mL，對照不加酶液，混合均勻，27 ℃水浴10 min，在紫外分光光度儀上340 nm處測定吸光度，重復(fù)3次。根據(jù)酶源蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果，將吸光度換算成比活力[ΔD/(mg·30 min)]。

1.4.3.5 MFO活性測定 取對硝基苯甲醚(0.1 mol/L、pH值為7.0)、磷酸緩沖液、NADPH和酶液分別為0.1、1.9、0.5、0.5 mL，對照不加酶液，混合搖勻，置于37 ℃水浴振蕩 30 min，然后加1.0 mL HCl溶液(1 mol/L)終止反應(yīng)，后用四氯甲烷、NaOH溶液(0.5 mol/L)萃取，在溫室下靜置10 min后，取 2.0 mL 水相置于比色皿中，在400 nm處測吸光度。根據(jù)各處理的吸光度與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較，計(jì)算MFO的比活力[nmol/(mg·30 min)]。

1.4.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 阿維菌素對朱砂葉螨的抗性選育結(jié)果數(shù)據(jù)及解毒酶活性數(shù)據(jù)處理均采用SPSS Statistics 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 木薯朱砂葉螨對阿維菌素抗性的選育

朱砂葉螨對阿維菌素抗性結(jié)果(表2)表明，通過從F1至F15代試蟲的逐次汰選和飼養(yǎng)，獲得F15代抗性倍數(shù)為3.25。LC50由2.830 μg/mL上升到9.208 μg/mL，F(xiàn)0～F6、F7～F12、F13～F15抗性倍數(shù)范圍分別在1.00～1.87、2.01～2.84、3.03～3.25內(nèi)。由此可見，阿素菌素對朱砂葉螨的抗藥倍數(shù)呈緩慢上升趨勢，抗性發(fā)展較慢，沒有出現(xiàn)抗性突增階段。

2.2 朱砂葉螨不同品系對CarE比活力的變化

由表3可知，與SS品系相比只有Ab-R15品系CarE比活力達(dá)到顯著性差異水平，為SS品系的1.27倍。除了Ab-R15品系外，其余2個(gè)抗性品系與SS品系CarE比活力差異均未達(dá)到顯著水平，說明阿維菌素抗性品系的形成與CarE比活力可能關(guān)系不大。

2.3 朱砂葉螨不同品系對GSTs比活力的變化

由表4可知，連續(xù)15代篩選，GSTs的比活力一直在上升中，Ab-R5品系比活力上升幅度最小，與SS品系之間沒有顯著性差異，篩選至10代，Ab-R10品系比活力上升較快，與 Ab-R5、SS品系之間差異達(dá)到顯著水平，為SS品系的1.43倍，說明朱砂葉螨對阿維菌素抗性水平的提高可能部分與GSTs比活力的提高有關(guān)。

2.4 朱砂葉螨不同品系對MFO比活力的變化

由表5可知，隨著選育代數(shù)的增加，MFO的比活力不斷增強(qiáng)，且上升幅度相對較大，Ab-R品系與SS品系之間MFO比活力差異均達(dá)到顯著性水平，Ab-R15品系是SS品系的1.92倍，從F5代到F15代MFO的活性上升較快，且與SS品系相比具有顯著差異，表明朱砂葉螨對阿維菌素產(chǎn)生的抗性與MFO比活力增強(qiáng)有直接關(guān)系， 而且是朱砂葉螨對阿維菌素產(chǎn)生抗藥性的重要原因。

表2 木薯朱砂葉螨抗阿維菌素品系選育結(jié)果

表3 朱砂葉螨不同品系對CarE比活力的變化

注：表中所示數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下表同。

表4 朱砂葉螨不同品系對GSTs比活力的變化

表5 朱砂葉螨不同品系對MFO比活力的變化

3 結(jié)論與討論

通過阿維菌素對木薯朱砂葉螨的室內(nèi)篩選，獲得F15代抗性為3.25倍的朱砂葉螨阿維菌素種群，在抗性篩選過程中發(fā)現(xiàn)該朱砂葉螨對阿維菌素的抗性發(fā)展速度慢，呈平緩的上升趨勢，沒有出現(xiàn)抗性突增階段，不易產(chǎn)生抗藥性，這與陳文博等的研究結(jié)果[6，8]一致。

室內(nèi)抗性選育是害蟲抗藥性研究的重要手段，抗藥性發(fā)展的速度和程度與害蟲種類、原始種群的抗性水平、藥劑種類及選擇壓力有關(guān)[16]。通過朱砂葉螨對阿維菌素的抗藥性研究結(jié)果表明，在實(shí)際生產(chǎn)中為預(yù)防朱砂葉螨對阿維菌素過快產(chǎn)生抗藥性，要適當(dāng)與常用藥劑進(jìn)行輪換或者選用混配藥劑，控制使用量和施用次數(shù)，從而延長阿維菌素的使用壽命，這樣才有可能阻止或延緩害螨抗藥性的發(fā)生。

本研究用阿維菌素經(jīng)F15代抗性選育后，對Ab-R品系和SS品系的3種解毒酶(CarE、GSTs和MFO)比活力測定表明，CarE比活力在F10代前基本沒有變化，Ab-R品系與SS品系之間的比活力差異不顯著；GSTs選育F10代時(shí)比活力變化顯著，Ab-R10品系比SS品系比活力提高1.43倍；MFO的比活力變化顯著且上升較快，說明朱砂葉螨體內(nèi)MFO在對阿維菌素的抗藥性中起主要作用，這與沈一凡等認(rèn)為MFO比活力增強(qiáng)是二斑葉螨對阿維菌素產(chǎn)生抗藥性的主要原因的結(jié)論[11-12]相印證。高新菊等報(bào)道二斑葉螨對四螨嗪產(chǎn)生抗性是3種解毒酶協(xié)同作用的結(jié)果[17]；劉金香等研究表明，水胺硫磷和甲氰菊酯的抗性形成與3種解毒酶有一定的關(guān)系[18]。同樣，筆者認(rèn)為木薯朱砂葉螨對阿維菌素抗性的形成與CarE、GSTs、MFO比活力的變化存在聯(lián)系，但MFO比活力的提高是導(dǎo)致朱砂葉螨抗性形成的重要原因。

本研究的木薯朱砂葉螨室內(nèi)抗性選育至F15代，如果抗性篩選不斷進(jìn)行，朱砂葉螨抗性會迅速上升。隨著抗性的增強(qiáng)，朱砂葉螨體內(nèi)3種解毒酶活性可能會有更大的變化，因此本課題有待今后繼續(xù)深入探討，為進(jìn)一步研究抗性治理提供科學(xué)的理論依據(jù)。