王霞霞， 高 平， 李 棟， 郝旺林， 何 真

(1.呂梁學院生命科學系，山西呂梁 033000； 2.山西省農(nóng)業(yè)科學院，山西太原 030006)

銀杏(GinkgobilobaL.)為銀杏科銀杏屬落葉喬木，別稱白果、公孫樹、鴨腳樹、蒲扇[1-3]，素有裸子植物“活化石”之稱，為中國獨存的珍稀名貴樹種[4-6]。銀杏及其愈傷組織中含有黃酮、雙黃酮等黃酮類化合物[7]，對心腦血管疾病具有獨特療效[8-9]，因此銀杏葉提取物及其制劑在國際市場上供不應求[3]。自然條件下，銀杏葉中黃酮含量也較高[10]。但銀杏栽培需要大量面積，生長周期長，且易受多種外界條件影響[11-12]。近年我國研究人員發(fā)現(xiàn)誘導的銀杏愈傷組織中也含有黃酮類物質(zhì)，目前有利用銀杏愈傷組織的細胞懸浮培養(yǎng)來生產(chǎn)黃酮類次生代謝產(chǎn)物的研究[13-15]。從愈傷組織中提取黃酮類物質(zhì)，能有效縮短生產(chǎn)周期，滿足工業(yè)化生產(chǎn)需要[1]，對黃酮類物質(zhì)生產(chǎn)量提高和加工產(chǎn)業(yè)發(fā)展有重大意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

銀杏葉片、葉柄、樹皮等外植體均采自呂梁學院校園內(nèi)銀杏樹。

1.2 試驗方法

采用L9(34)正交設計表選擇最適合外植體的消毒配比，外植體(A)選擇葉片、葉柄、樹皮。將10%次氯酸鈉消毒時間(B)設計為3個梯度3、6、9 min，將75%乙醇消毒時間(C)設計為3個梯度分別為40、50、60 s(表1)。

表1 外植體和消毒時間的正交設計因素和水平

采用L9(34)正交設計表選擇誘導銀杏愈傷組織最適宜激素種類和濃度配比，KT水平設置為0、0.2、0.4 mg/L，6-BA水平設置為0.5、1.0、1.5 mg/L，2，4-D水平設置為0、0.5、1.0 mg/L(表2)。

表2 誘導愈傷組織的正交設計因素和水平

采用L9(34)正交設計表選擇愈傷組織增殖最適宜激素濃度配比，KT水平設置為1.0、1.5、2.0 mg/L，6-BA水平設置為0.5、1.0、1.5 mg/L，2，4-D水平設置為0.0、1.0、2.0 mg/L，NAA水平設置為0.5、1.0、1.5 mg/L(表3)。

表3 愈傷組織增殖的正交設計因素和水平

1.3 雙黃酮提取

應用十字交叉法隨機取樣愈傷組織，放置在60 ℃電熱鼓風干燥箱中烘干至恒質(zhì)量；把烘干的愈傷組織置于研磨器中研磨成粉末，在冷凍箱中冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

用醇提法[16]提取愈傷組織中的雙黃酮；以蕓香苷為標準品制作標準曲線[17-18]，采用高效液相色譜儀[19-20]測量雙黃酮的含量。

1.4 計算及數(shù)據(jù)處理

存活率=存活的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%；

愈傷組織誘導率=誘導產(chǎn)生愈傷組織的個體數(shù)/存活個體數(shù)×100%；

愈傷組織增殖倍數(shù)=(培養(yǎng)30 d后裝有愈傷組織培養(yǎng)皿質(zhì)量-取出愈傷組織培養(yǎng)皿質(zhì)量)/(接種愈傷組織后培養(yǎng)皿質(zhì)量-接種前裝有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿質(zhì)量)。

數(shù)據(jù)用SPSS軟件處理。

蕓香苷標準曲線方程為：y=0.062 4x+13.943 6；雙黃酮得率依據(jù)梁文惠等的方法[18]計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒劑消毒時間對不同外植體成活率的影響

由表4可知，葉片作為外植體成活率明顯高于葉柄和樹皮。10% NaClO消毒時間6 min成活率明顯高于3 min和 9 min，說明10% NaClO消毒時間過長和過短都不利于外植體的成活。75%乙醇消毒時間為40 s成活率高于50 s和 60 s，說明乙醇消毒時間不宜過長。又經(jīng)極差分析可知，外植體、10% NaClO、75%乙醇的成活率極差分別為13.36、26.75、9.30百分點，因此，影響外植體成活的主次關系為：10% NaClO>外植體>75%乙醇。由此可得到最優(yōu)水平組合為A1B2C1，即外植體為葉片、10% NaClO消毒時間為6 min，75%乙醇消毒時間為40 s。

表4 不同消毒時間外植體成活率L9(34)正交試驗結(jié)果

將上述最優(yōu)消毒條件組合進行一次驗證試驗，得到外植體成活率為84.21%，高于表4中所有9組試驗的成活率，故確定最優(yōu)試驗組合為A1B2C1。

2.2 不同激素濃度對愈傷誘導的影響

由表5可知，0.2 mg/L的KT誘導率均高于不加KT和0.4 mg/L KT，說明KT濃度過低和過高都不利于誘導愈傷組織。1.0 mg/L 6-BA誘導率高于0.5 mg/L 6-BA和 1.5 mg/L 6-BA，說明適宜的6-BA濃度有利于誘導愈傷組織。1.0 mg/L 2，4-D誘導率高于0.5 mg/L，說明要誘導愈傷組織2，4-D濃度不能過低。經(jīng)極差分析可知，KT、6-BA、2，4-D的誘導率極差為11.11、8.89、15.55百分點，因此，影響愈傷組織誘導的主次關系為：2，4-D>KT>6-BA。由此可得到最優(yōu)水平組合為D2E2F3，即0.4 mg/L KT、1.0 mg/L 6-BA、1.0 mg/L 2，4-D。

表5 不同激素濃度對愈傷誘導率L9(34)正交試驗結(jié)果

設計的9組試驗中5號試驗與理論最優(yōu)組合吻合，故不用再做對比試驗，最優(yōu)組合為5號試驗，即D2E2F3。

2.3 不同激素濃度對愈傷組織增殖的影響

由表6可知，1.5 mg/L KT的增殖倍數(shù)均高于1.0 mg/L KT和2.0 mg/L KT，說明KT濃度過低和過高都不利于愈傷組織增殖。1.0 mg/L 6-BA增殖倍數(shù)高于0.5 mg/L 6-BA和1.5 mg/L 6-BA，說明適宜的6-BA濃度有利于愈傷組織增殖。2.0 mg/L 2，4-D增殖倍數(shù)高于不加和加1.0 mg/L 2，4-D，說明愈傷組織增殖的2,4-D濃度不能過低。1.5 mg/L NAA增殖倍數(shù)高于0.5 mg/L和1.5 mg/L NAA，說明愈傷組織增殖NAA濃度也不能過低。經(jīng)極差分析可知，KT、6-BA、2，4-D、NAA的增殖倍數(shù)極差為1.08、0.18、0.28、0.17，因此，影響愈傷組織誘導的主次關系為：KT>2，4-D>6-BA>NAA。由此可得到最優(yōu)水平組合為G2H2I3J3，即：1.5 mg/L KT、1.0 mg/L 6-BA、2.0 mg/L 2，4-D、1.5 mg/L NAA。驗證試驗結(jié)果表明：該組合條件下的愈傷組織增殖倍數(shù)為2.92，高于設計的9組試驗的增殖倍數(shù)，可以確定該組合為最優(yōu)條件。

2.4 愈傷組織中雙黃酮的含量

試驗結(jié)果表明，愈傷組織中雙黃酮在波長260 nm處有最大吸收峰，與雙黃酮標準樣品的吸收峰波長在60 min出峰，峰形尖銳而且沒有雜峰。樣品在相應的時間段內(nèi)也出峰，與標準樣品出峰時間基本吻合。由標準曲線、峰面積，對標樣濃度計算相關系數(shù)為0.9962，相關性好。參照蕓香苷標準曲線算得的雙黃酮得率為15.62 mg/g。

表6 不同激素對愈傷組織增殖L9(34)正交試驗結(jié)果

3 討論與結(jié)論

由于主客觀條件的局限性，對成活的外植體沒有進行脫毒檢測，再后期的繼代增殖中容易爆發(fā)大范圍的感染。對于外植體消毒試驗應該對試驗過程產(chǎn)生的各種微生物進行分離純化，鑒定微生物的種類和分析微生物產(chǎn)生的原因。

在正交試驗中2，4-D的濃度沒有篩選出最佳濃度，在后期的試驗中應對其設置多個濃度梯度進行單因素試驗，篩選出2，4-D的濃度對誘導愈傷組織的最佳濃度，這樣試驗才更具完整性和精確性。

愈傷組織雙黃酮的得率比自然條件下葉片的得率高，但與鄧祥宜等的得率[21]有差別。可能與愈傷組織的生長增殖的速率和繼代次數(shù)有關，也可能與雙黃酮的提取條件有關。在后續(xù)的試驗中應進一步研究不同時期的愈傷組織和增殖代數(shù)對雙黃酮含量的影響和提取條件的優(yōu)化。

用銀杏愈傷組織提取雙黃酮的提取率比較高[21]，而且比用銀杏葉提取雙黃酮提取率要高得多[22]。這樣可以打破季節(jié)的束縛，也可以提高雙黃酮的獲得量，可以很好地滿足市場需求。