于 妍， 姜 威， 陳慶山， 邱紅梅， 管 宇， 蔣洪蔚， 李燦東， 唐敬仙

(1.長(zhǎng)春科技學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130600； 2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030； 3.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大豆研究所，吉林長(zhǎng)春 130033；4.黑河出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)中心，黑龍江黑河 164300； 5.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院佳木斯分院，黑龍江佳木斯 154007)

大豆(Glycinemax)是重要的油料作物、經(jīng)濟(jì)作物，植物性蛋白質(zhì)的重要來(lái)源之一便是大豆蛋白質(zhì)，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高。大豆中人體必需的氨基酸含量豐富，其中賴氨酸含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于谷物。由于賴氨酸能夠促進(jìn)人體充分吸收和利用其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，一旦缺乏將直接或間接影響機(jī)體的生長(zhǎng)和發(fā)育，所以進(jìn)一步提高大豆中的賴氨酸含量十分必要。在植物賴氨酸合成途徑中，二氫吡啶、二羧二氫吡啶、二羧酸先后在2，3-二氫吡啶二羧酸還原酶(DHDPR)、二氨基庚二酸異構(gòu)酶(DAPE)、N-α-?；?L，L-二氨基庚二酸脫酰酶(ADPD)的催化下生成賴氨酸[1]。表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequence tag，簡(jiǎn)稱EST)已經(jīng)成為人類(lèi)克隆不同物種特異性表達(dá)基因以及尋找未知基因的重要手段[2-3]。截至目前，已有多項(xiàng)研究通過(guò)電子克隆手段獲得了許多人類(lèi)功能基因[4-6]。但是由于目標(biāo)物種序列信息有限，所以在植物基因克隆研究中，大部分試驗(yàn)方法仍局限于原有的、常規(guī)的思路。但是，隨著植物EST數(shù)據(jù)庫(kù)的逐步完善，其信息量快速增加，借助生物信息學(xué)技術(shù)來(lái)電子克隆基因勢(shì)必成為基因克隆的一個(gè)方便快捷、有效的途徑。另外，在分子標(biāo)記研究領(lǐng)域，目前的研究多是將標(biāo)記定位在連鎖群上的，真正的基因定位鮮見(jiàn)報(bào)道。如果以基因自身的序列為依據(jù)，進(jìn)而獲得連鎖群的定位，這樣可以實(shí)現(xiàn)基因更加準(zhǔn)確精細(xì)的定位。

本研究利用電子克隆手段，獲得了大豆賴氨酸合成3個(gè)關(guān)鍵酶基因的全長(zhǎng)cDNA序列，同時(shí)以已構(gòu)建的大豆基因組遺傳圖和物理圖的整合圖譜為基礎(chǔ)，完成這些基因的定位，并通過(guò)cDNA和gDNA序列的比對(duì)，獲得所有基因的結(jié)構(gòu)信息，從而為后續(xù)基因功能的研究及分子輔助育種打下良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 序列信息下載及生物軟件

本研究從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，簡(jiǎn)稱NCBI)網(wǎng)站上分別下載了不同外源物種賴氨酸合成3個(gè)關(guān)鍵酶基因信息(表1)，并用phytozome網(wǎng)站(http：//www.phytozome.net/soybean.php)進(jìn)行在線比對(duì)。從phytozome網(wǎng)站(http：//soybase.org/SequenceIntro.php)下載獲得標(biāo)記圖譜BARCSOYSSR Potential SSR Database。從NCBI的FTP網(wǎng)站(ftp：//ftp.ncbi.nih.gov/blast/executables/release/2.2.16/)下載用于本地比對(duì)的blast2.2.16軟件包。利用DNAMan軟件進(jìn)行EST片段比對(duì)，并篩選序列進(jìn)行拼接。

表1 外源物種賴氨酸合成關(guān)鍵酶基因信息

1.2 試驗(yàn)植物

先將大豆品種東農(nóng)42的種子在自來(lái)水中浸泡過(guò)夜，再將吸脹后的種子種在花盆中，于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待長(zhǎng)出3出復(fù)葉后，將幼嫩的葉片取下用作試驗(yàn)材料。

1.3 電子克隆

本研究依據(jù)不同物種間存在相同基因核苷酸序列同源性較高的特點(diǎn)，借助已構(gòu)建的本地化大豆EST數(shù)據(jù)庫(kù)，將已獲得的不同物種的賴氨酸合成關(guān)鍵酶基因序列利用Blast軟件與其進(jìn)行比對(duì)，從比對(duì)出的數(shù)條EST序列中選取多條同源性高，且能完全覆蓋整個(gè)基因cDNA片段的EST序列才可進(jìn)行后續(xù)拼接工作。利用DNAMan 5.0軟件的Multiple sequence alignment功能將目的基因與其同源序列進(jìn)行聯(lián)配分析，之后運(yùn)用Sequence Assembly工具對(duì)所選EST序列進(jìn)行進(jìn)一步拼接組裝完成電子延伸，進(jìn)而獲得全長(zhǎng)基因序列。

1.4 引物設(shè)計(jì)

以拼接預(yù)測(cè)的基因序列為模版，利用DNAMan軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列見(jiàn)表2。引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表2 賴氨酸合成關(guān)鍵酶基因引物信息

1.5 大豆葉片總RNA提取及第一鏈cDNA的合成

依據(jù)TRIzol說(shuō)明書(shū)提供的方法進(jìn)行大豆葉片總RNA的提取。參照M-MLV使用說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一鏈，直接用作模板用于PCR擴(kuò)增。

1.6 基因的克隆及測(cè)序

以東農(nóng)42大豆品種cDNA作為模板，利用已設(shè)計(jì)的大豆DAPD、DAPE和DHDP3個(gè)酶基因特異引物，借助PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)基因片段。反應(yīng)條件如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 35 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 2 min，28個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。待反應(yīng)結(jié)束后，分別取10 μL PCR產(chǎn)物于10 g/L瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(cè)?；厥漳康钠尾⑦B接到pGEM T-easy載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichiacoli) DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在氨芐青霉素(Amp)抗性X-gal/IPTG LB培養(yǎng)基平板上將白色克隆挑出，并送交生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.7 基因的電子定位

將已獲得的3個(gè)大豆賴氨酸合成關(guān)鍵酶基因序列與本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，將獲得的序列與從phytozome網(wǎng)站下載的數(shù)據(jù)庫(kù)再一次進(jìn)行比對(duì)分析，由此便可準(zhǔn)確地將基因定位在遺傳圖譜上。結(jié)合Song等已構(gòu)建的圖譜[7]，進(jìn)而確定這些基因定位的連鎖群以及距基因較近的兩側(cè)標(biāo)記信息。

1.8 基因結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)比對(duì)分析結(jié)果，進(jìn)一步確定基因的內(nèi)含子與外顯子數(shù)量，從而獲得基因的精細(xì)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆賴氨酸合成關(guān)鍵酶基因的電子克隆

2.1.1 基因的電子預(yù)測(cè) 本試驗(yàn)將獲得的不同外源基因序列與已構(gòu)建的大豆本地化EST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，從比對(duì)結(jié)果中選取多條同源性高的序列，并進(jìn)行拼接，進(jìn)而獲得全長(zhǎng)基因，從而預(yù)測(cè)出目的基因的全長(zhǎng)序列。經(jīng)比對(duì)、拼接，大豆賴氨酸合成3個(gè)關(guān)鍵酶基因的全長(zhǎng)序列預(yù)測(cè)信息見(jiàn)表3。

表3 大豆賴氨酸合成關(guān)鍵酶基因的預(yù)測(cè)信息

2.1.2 基因的RT-PCR鑒定與測(cè)序結(jié)果分析 以大豆品種東農(nóng)42葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增，獲得大豆DAPD、DAPE和DHDPR3個(gè)關(guān)鍵酶基因PCR產(chǎn)物，經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示泳道均出現(xiàn)單一條帶，DAPD、DAPE、DHDPR3個(gè)關(guān)鍵酶基因大小分別約為1 460、1 080、1 030 bp，全部與預(yù)測(cè)的基因長(zhǎng)度相符(圖1)。將3個(gè)PCR產(chǎn)物分別與pGEM-T easy載體連接，進(jìn)而獲得對(duì)應(yīng)的重組質(zhì)粒。最后將重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)電泳檢測(cè)，證實(shí)結(jié)果均與預(yù)測(cè)基因長(zhǎng)度相符。

借助DNAMan軟件，將大豆賴氨酸合成DAPD、DAPE和DHDPR3個(gè)關(guān)鍵酶基因重組質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果與之前的預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示，在核苷酸水平上，所獲得的3個(gè)基因cDNA序列與預(yù)測(cè)序列的同源性分別為99.66%、99.17%、95.94%。利用EBI→InterProScan分別對(duì)DAPD、DAPE和DHDPR3個(gè)酶基因編碼的蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)。由表4可以看出，DAPD、DAPE、DHDPR3個(gè)關(guān)鍵酶基因含有的保守結(jié)構(gòu)域分別具有2，6-二氨基庚二酸脫羧酶、二氨基庚二酸異構(gòu)酶和2，3-二氫吡啶二羧酸還原酶功能。通過(guò)以上分析，進(jìn)一步驗(yàn)證了通過(guò)電子克隆獲得的這3個(gè)全長(zhǎng)基因序列是正確的。

2.2 大豆賴氨酸合成關(guān)鍵酶基因的電子定位與結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 基因的物理圖定位 借助大豆基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，將已獲得的基因序列片段與之進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)而完成物理圖定位分析。如果與基因組進(jìn)行比對(duì)時(shí)出現(xiàn)多個(gè)片段同時(shí)匹配的情況，是由于該基因具有內(nèi)含子。表5中顯示了基因以及與基因組匹

表4 大豆賴氨酸合成關(guān)鍵酶基因編碼蛋白保守結(jié)構(gòu)域信息

表5 大豆賴氨酸合成關(guān)鍵酶基因的物理圖定位

配區(qū)段的信息，此外還可以看出，E值均趨近于0，平均匹配率均在99%以上。這些數(shù)據(jù)足以說(shuō)明，這些基因與基因組序列的匹配是真實(shí)且可信的。

2.2.2 基因的遺傳圖定位 根據(jù)賴氨酸合成3個(gè)關(guān)鍵酶基因與基因組匹配區(qū)段，同時(shí)參考標(biāo)記圖譜BARCSOYSSR Potential SSR Database，DAPD、DAPE和DHDPR3個(gè)基因分別定位在L、N、J 3個(gè)連鎖群上，獲得了基因的兩側(cè)標(biāo)記以及定位區(qū)間。由表6、圖2可以看出，DAPD基因被定位在L連鎖群Super40的314 760～319 421之間，且BARC-014655-01607-BARC-028787-06014是分別位于此區(qū)間兩側(cè)最近的標(biāo)記，距離是1.1 cM；DAPE基因被定位在N連鎖群Super62的2 825 711～2 829 438之間，且BARC-024329-04849-BARC-028205-05792是分別位于此區(qū)間兩側(cè)最近的標(biāo)記，距離是0.6 cM；DHDPR基因被定位在J連鎖群Super154的1 521 652～1 524 809之間，BARC-022453-04332-BARC-014459-01381是分別位于此區(qū)間兩側(cè)最近的標(biāo)記，且定位于連鎖群的同一位置，定位距離是3個(gè)基因中最近的。

表6 大豆賴氨酸合成關(guān)鍵酶基因遺傳圖基因定位

2.2.3 基因結(jié)構(gòu)分析 通過(guò)對(duì)大豆賴氨酸合成3個(gè)關(guān)鍵酶基因進(jìn)行cDNA和gDNA序列的比對(duì)，進(jìn)一步確定各個(gè)基因長(zhǎng)度以及外顯子、內(nèi)含子的數(shù)量。表7結(jié)果顯示，DAPD、DAPE、DHDPR3個(gè)酶基因cDNA長(zhǎng)度分別為1 467、1 080、1 035 bp；gDNA的長(zhǎng)度分別為4 662、3 728、3 158 bp；外顯子數(shù)量分別為8、9、8個(gè)；內(nèi)含子的數(shù)量分別為7、8、7個(gè)。

表7 賴氨酸合成關(guān)鍵酶基因結(jié)構(gòu)比對(duì)信息

3 討論與結(jié)論

3.1 大豆賴氨酸合成關(guān)鍵酶基因的電子克隆

目前，電子克隆方法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于很多領(lǐng)域，例如在人[8]、甘藍(lán)[9]和牛[10]的研究中均有報(bào)道。但大部分研究?jī)H局限于利用外源物種核苷酸或氨基酸序列與GenBank網(wǎng)站上提供的EST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，且由于EST數(shù)據(jù)庫(kù)中的信息包含多個(gè)物種，所以造成信息量過(guò)大，因而比對(duì)起來(lái)必然存在以下問(wèn)題：(1)時(shí)效性差；(2)會(huì)將許多不需要的物種信息同時(shí)比對(duì)出來(lái)，所以不僅須要比對(duì)多次，另外還須對(duì)結(jié)果進(jìn)行細(xì)致篩選，為序列拼接帶來(lái)不必要的麻煩。本研究在成功構(gòu)建大豆EST數(shù)據(jù)庫(kù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行本地比對(duì)，這樣針對(duì)性更強(qiáng)，結(jié)果更準(zhǔn)確。由此可見(jiàn)，以本地化EST數(shù)據(jù)庫(kù)為基礎(chǔ)進(jìn)行基因電子克隆，既準(zhǔn)確又快捷。

3.2 大豆賴氨酸合成關(guān)鍵酶基因的電子定位

目前，針對(duì)大豆脂肪酸含量[11]、種子油分和蛋白[12]、大豆花葉病毒抗性[13]及胞囊線蟲(chóng)抗性[14]等性狀的基因定位均有報(bào)道，但關(guān)于基因方面的研究并不多見(jiàn)。本研究借助已有的大豆基因信息，構(gòu)建了本地化EST數(shù)據(jù)庫(kù)。同時(shí)利用生物學(xué)軟件，完成了基因準(zhǔn)確、快速的定位。而傳統(tǒng)的分子標(biāo)記，需要一定的群體以及大量人力、物力，既耗時(shí)又費(fèi)力?；螂娮佣ㄎ皇墙柚镄畔W(xué)相關(guān)軟件并建立在測(cè)序基礎(chǔ)之上的另一種用于基因定位的手段，其獲得的基因兩側(cè)標(biāo)記與基因位點(diǎn)之間的物理距離非常近，可為今后基于基因分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)奠定良好基礎(chǔ)，從而真正完成基因準(zhǔn)確精細(xì)的定位。

由本試驗(yàn)結(jié)果還可以看出，通過(guò)基因的電子定位，不僅能夠更加快速、準(zhǔn)確地相互找到對(duì)應(yīng)標(biāo)記，同時(shí)還能獲得相鄰序列的信息，這樣就可以挖掘更多未知的功能性基因，進(jìn)而完成QTL到QTG更深入的轉(zhuǎn)換，同時(shí)也很好地將挖掘基因與遺傳作圖二者密切地聯(lián)系在一起。除此之外，電子定位還可將基因cDNA序列和gDNA序列進(jìn)行比對(duì)，同時(shí)對(duì)精細(xì)的基因結(jié)構(gòu)，即內(nèi)含子與外顯子信息進(jìn)行分析，為后續(xù)進(jìn)一步研究基因提供了必要條件。目前基于基因序列的研究大部分仍然局限于cDNA水平， 卻忽視了基于gDNA水平上基因結(jié)構(gòu)的分析，本研究對(duì)這方面內(nèi)容進(jìn)行了有效的補(bǔ)充。