余乃通 ，李賓賓，2，黎維麗，2，楊 毅 ，劉志昕

（1. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所/海南省微生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571101；2. 海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院, 海南 ?？?570228；3. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所， 海南 ?？?571101）

柑桔黃龍?。–itrus Huanglongbing, HLB）是柑桔類作物一種毀滅性病害，嚴(yán)重威脅著世界各地柑桔類作物主產(chǎn)區(qū)的生產(chǎn)［1-2］。目前該病害已相繼在亞洲、非洲、大洋洲和美洲的50多個國家和地區(qū)報道，引起柑桔產(chǎn)業(yè)的巨大經(jīng)濟(jì)損失［1，3］。在我國19個柑桔主產(chǎn)區(qū)中，已有11個遭受到HLB危害［4-5］。柑桔黃龍病的病原是一種專性寄生于植物韌皮部的革蘭氏陰性菌，屬韌皮部桿菌屬（CandidatusLiberibacter），目前有3個種，即亞洲種（CandidatusLiberibacter asiaticus）、非洲種（CandidatusLiberibacter africanus）和美洲種（CandidatusLiberibacter americanus）［6］，主要由亞洲柑桔木虱（Diaphorina citri）和非洲柑桔木虱（Trioza erytreae）傳播［7］。

近年來，隨著海南綠橙等柑桔類產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，柑桔黃龍病也隨之而來和快速傳播［8］。前期，我們從感染HLB的海南綠橙中篩選出表達(dá)量較高的1個分泌蛋白，菌毛形成蛋白（Pilus formation protein，408），與菌毛組裝相關(guān)［9］。革蘭氏陰性菌含有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ類等8個不同類型的蛋白分泌系統(tǒng)［10］。研究表明，細(xì)菌分泌蛋白對病原菌感染宿主和引起宿主病變等方面起到重要作用［11-13］。柑桔黃龍病菌含有完整的Ⅰ類蛋白分泌系統(tǒng)和不完整的Ⅲ類和Ⅳ類蛋白分泌系統(tǒng)［14］。

本研究從感染HLB的海南綠橙中擴(kuò)增出408蛋白基因，序列分析表明，408基因與柑桔黃龍病菌亞洲種psy62 株系（GenBank登錄號：CP001677.5）的408基因序列一致［15］。對該蛋白進(jìn)行原核表達(dá)及抗血清制備，得到了特異性強(qiáng)的408抗血清，工作效價在1∶500～1∶10 000之間。本研究制備的408多抗血清為408蛋白的功能研究和柑桔黃龍病菌的蛋白檢測產(chǎn)品開發(fā)提供重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

感染柑桔黃龍病的綠橙葉片采自海南省瓊海市，-80℃保存；pET32a載體由本實(shí)驗(yàn)室保存；E. coliBL21 （DE3）菌株購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；EcoRⅤ和XhoⅠ均購自大連寶生物公司；HSTMMIX購自東盛生物公司；植物基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；BCIP/NBT底物顯色試劑盒、氨芐青霉素（Ampicillin）、Isopropyl β-D-Thiogalactoside（IPTG）、丙烯酰胺、N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷（Tris）購自Solarbio公司；十二烷基硫酸鈉（SDS）、甘氨酸、考馬斯亮藍(lán)R-250均購自海南愛斯科坦生物公司；PCR產(chǎn)物回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司；堿性磷酸酯酶（AP）標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購自Biosharp生物公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購自碧云天生物技術(shù)公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計 根據(jù)柑桔黃龍病菌408分泌蛋白基因（GenBank登錄號：CP001677.5）編碼區(qū)核苷酸序列和pET32a載體多克隆酶切位點(diǎn)設(shè)計1對特異性引物，408-F （5’-CCG GAT ATC TTG CAT CGT AAG CGC CAA AGA G-3’，下劃線為EcoRⅤ酶切位點(diǎn)）和408-R （5’-CCGTCC TGA CGG GAG GAG AGG AGG-3’，下劃線為XhoⅠ酶切位點(diǎn)），由深圳華大基因股份有限公司（BGI）合成。

1.2.2 總DNA的提取及408基因的克隆 以感染HLB的綠橙葉片為材料，參照天根植物基因組DNA提取試劑盒操作說明進(jìn)行總DNA的提取，用408-F和 408-R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為：DNA模板2 μL，正反引物各 2 μL（10 μmol/L），dNTPs 4 μL，5×TaqBuffer 10 μL，TaqDNA polymerase 1 μL，加ddH2O到50 μL。PCR程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s，共35個循環(huán)；72℃延伸10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 pET32a-408表達(dá)載體的構(gòu)建 利用OMEGA公司的膠回收試劑盒對408目的基因進(jìn)行回收，對回收的408基因產(chǎn)物和pET32a載體進(jìn)行EcoRⅤ和XhoⅠ雙酶切，經(jīng)T4DNA連接酶將408基因連接到pET32a載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH 5α菌株，涂布于含50 μg/mL氨芐（Amp）抗性的固體LB平板上，37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)進(jìn)行抗性篩選。挑取平板上的單克隆菌落，利用408-F和 408-R引物進(jìn)行菌液PCR鑒定，隨機(jī)選取3個大小正確的單克隆菌落送往賽默飛世爾科技（中國）有限公司進(jìn)行雙向測序。對測序正確的單克隆菌落提取重組載體，進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。將經(jīng)過測序和雙酶切驗(yàn)證的重組載體命名為pET32a-408。

1.2.4 408蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析 對測序正確的重組載體轉(zhuǎn)化E .coliBL21 （DE3）菌株，挑取平板上的單克隆菌落接種到液體LB培養(yǎng)基（含100 μg/mL的Amp），37℃于200 r/min培養(yǎng)過夜。以1∶50的比例將過夜培養(yǎng)的菌液接種到150 mL液體LB培養(yǎng)基中（含100 μg/mL的Amp），37℃、200 r/min繼續(xù)培養(yǎng)，期間取樣測菌液OD600值，待菌液OD600達(dá)到0.6～1.0，加入IPTG使其終濃度為1 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)6 h。菌液于12 000 r/min離心，收集沉淀，溶于15 mL的1×PBS緩沖液中，超聲波破碎20 min（連續(xù)循環(huán)工作4 s，停止8 s）；12 000 r/min 離心5 min，分別取上清和沉淀（溶于8 mol/L尿素的15 mL Lysis buffer）10 μL與等量體積的2×SDS loading buffer混合后，100℃煮沸10 min，進(jìn)行12%SDS-PAGE凝膠電泳（90 V, 2 h）。

1.2.5 融合蛋白的純化 用含8 mol/L尿素的15 mL Lysis buffer溶解超聲波破碎后的沉淀，8 000 r/min離心除去不溶性物質(zhì)，上清過0.45 μm濾膜，然后通過Ni2+-NTA親和層析柱進(jìn)行純化，經(jīng)washing buffer溶液洗去雜蛋白后，用不同濃度的咪唑（50、100、150、200、250 mmol/L）洗脫液進(jìn)行洗脫，于12% SDS-PAGE凝膠電泳檢測。將純化后的蛋白于-20℃保存。

1.2.6 抗血清的制備 取純化后溶于150 mmol/L咪唑的408蛋白溶液20 μL與80 μL 1×PBS緩沖液混合，再與100 μL的弗氏不完全佐劑混勻，腹腔免疫小白鼠；而后每隔7 d再次腹腔免疫小白鼠4次（使用弗氏完全佐劑）。最后一次免疫4 d后，對小白鼠進(jìn)行眼球取血，室溫放置30 min后，于4℃靜置過夜。5 000 r/min離心10 min，取上層血清，分裝后于-80℃保存。同時，使用1×PBS緩沖液作為對照免疫小白鼠，即對照血清。

1.2.7 抗體效價檢測及特異性檢測 使用間接ELISA法測定408多抗血清的效價［16］。將獲得408多抗血清分別按1∶500、1∶1 000、1∶5 000、1∶10 000、1∶50 000、1∶100 000的比例進(jìn)行稀釋。將純化后的408蛋白（用包被液1∶1 000稀釋）100 μL加入到96孔板中，37℃孵育2 h；1×PBST緩沖液洗滌3次后，加入200 μL的1%BSA封閉液，37℃封閉2 h；重復(fù)洗滌3次后，加入100 μL稀釋后的血清，37℃孵育1 h；重復(fù)洗滌3次后，加入100 μL HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG（1∶3 000），37℃孵育30 min；重復(fù)洗滌3次后，加入100 μL TMB底物顯色液，避光條件顯色15 min后，加入50 μL的濃鹽酸終止反應(yīng)，使用酶標(biāo)儀測定OD450的值。

取純化后溶于150 mmol/L咪唑的408蛋白溶液20 μL與等量體積的2×SDS loading buffer混合，100℃煮沸10 min變性，于12%的SDS-PAGE凝膠電泳。電泳結(jié)束后，將蛋白凝膠和硝酸纖維素膜（NC膜）預(yù)先用轉(zhuǎn)膜液浸泡5 min，放入半干轉(zhuǎn)膜儀中，電流1A轉(zhuǎn)膜25 min。轉(zhuǎn)膜完成后用1×TBST緩沖液清洗NC膜3次；5%脫脂奶粉封閉液進(jìn)行封閉2 h；1×TBST緩沖液清洗3次后，置于408多抗血清（1∶1 000）孵育1 h；1×TBST緩沖液清洗3次后，置于堿性磷酸酯酶（AP）標(biāo)記山羊抗小鼠IgG稀釋液（1∶2 000）孵育30 min；1×TBST緩沖液清洗3次后，使用BCIP/NBT顯色試劑盒顯色，拍照保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 408基因的克隆及其序列分析

以HLB感染的綠橙總DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果見圖1A，在250～500 bp之間有一條特異性DNA條帶，大小為400 bp左右，與目的基因大小一致。測序結(jié)果經(jīng)NCBI blastn分析表明，該基因?yàn)楦探埸S龍病菌的408分泌蛋白基因，與Duan等報道的柑桔黃龍病菌亞洲種psy62 株系（GenBank登錄號：CP001677.5）的408基因序列一致［15］，大小為408 bp，編碼135個氨基酸，分子量大小為14.95 ku。

圖1 408基因擴(kuò)增及pET32a-408質(zhì)粒酶切驗(yàn)證

圖2 柑桔黃龍病菌408同源蛋白的多重序列比對

氨基酸比對分析表明，海南柑桔黃龍病菌408蛋白與柑桔黃龍病菌亞洲種的408蛋白同源性為69.7%～100%；與馬鈴薯斑紋病菌（CandidatusLiberibacter solanacearum）的408蛋白同源性在35.2%～48.9%。NCBI保守結(jié)構(gòu)域（NCBI conserved domain）預(yù)測分析表明，本研究獲得的408蛋白含有1個高度可信的菌毛形成蛋白N端結(jié)構(gòu)域（Pilus formation protein N terminal domain），以及C端含有兩個高度保守的基序，Motif 1和Motif 2；對菌毛形成蛋白N端結(jié)構(gòu)域進(jìn)行同源比較，結(jié)果表明，本研究獲得的408蛋白其菌毛形成蛋白N端結(jié)構(gòu)域與其他柑桔黃龍病菌亞洲種408蛋白的該結(jié)構(gòu)域同源性均為100%，而與馬鈴薯斑紋病菌408蛋白的該結(jié)構(gòu)域同源性為60.2%～63%，說明該結(jié)構(gòu)域具有高度保守的種屬特異性（圖2）。

2.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

測序結(jié)果表明，3個單克隆菌中的408基因插入片段大小正確，堿基無缺失、突變發(fā)生，且編碼框無移位。雙酶切驗(yàn)證如圖1B所示，特異性獲得酶切后的408基因和pET32a載體片段。將經(jīng)過測序和雙酶切驗(yàn)證的重組載體命名為pET32a-408，作為后續(xù)原核表達(dá)的重組質(zhì)粒。

2.3 408蛋白的原核表達(dá)及可溶性分析

將pET32a-408重組載體轉(zhuǎn)化BL21 （DE3）表達(dá)菌，挑取轉(zhuǎn)化平板上的單克隆菌落接種到含氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，分離上清和沉淀進(jìn)行可溶性分析。12% SDSPAGE凝膠電泳表明，與未誘導(dǎo)的重組菌相比，經(jīng)1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)6 h后的重組菌在分子量大小約34 ku處，出現(xiàn)一條清晰的蛋白條帶（圖3A），與預(yù)測的408融合蛋白33.82 ku大小基本一致，即408融合蛋白。可溶性分析結(jié)果表明，408融合蛋白主要以沉淀形式（包涵體）表達(dá)（圖3B）。

圖3 408融合蛋白的原核表達(dá)及可溶性分析

2.4 融合蛋白純化

由于408融合蛋白含有His標(biāo)簽，可經(jīng)過Ni2+-NTA親和層析柱純化。將含有408融合蛋白的包涵體沉淀溶解，用不同咪唑濃度的洗脫液洗脫純化，最后用SDS×PAGE分析該蛋白在不同咪唑濃度洗脫液中的分布情況，結(jié)果見圖4，經(jīng)100 mmol/L咪唑的洗脫液洗脫后，Ni2+-NTA親和層析柱上的雜蛋白可除去大部分；再經(jīng)150 mmol/L咪唑的洗脫液洗脫后，大部分408融合蛋白從Ni2+-NTA親和層析柱中洗脫下來，而在200、250 mmol/L咪唑的洗脫液中分布很少。由此可見，經(jīng)不同咪唑濃度的洗脫液洗脫后，408融合蛋白主要在150 mmol/L咪唑的洗脫液中分布，于-20℃保存，備用。

圖4 不同濃度咪唑溶液對408融合蛋白的洗脫

2.5 408多抗血清效價及特異性

對408多抗血清進(jìn)行不同比例稀釋，以純化后的408融合蛋白（1∶1 000稀釋）為抗原，通過ELISA方法對408多抗血清進(jìn)行效價測定。結(jié)果分析表明，與對照血清相比，408多抗血清在稀釋 500、1 000、5 000、10 000倍時，408多抗血清呈明顯的陽性反應(yīng)（判斷標(biāo)準(zhǔn)為408 PcAb的OD450值/PBS PcAb的OD450值＞2.1）；而408多抗血清在稀釋10 000倍以上均不能很好地呈陽性反應(yīng)（圖5）。Western blotting結(jié)果分析表明，408多抗血清能與純化后的融合蛋白起特異性反應(yīng)，無其他明顯雜帶（圖6）。

圖5 408多抗血清效價檢測

圖6 Western blot檢測408抗體的特異性

3 結(jié)論與討論

前期，我們通過PCR、qPCR和RT-qPCR的方法從感染HLB的海南綠橙樣品中篩選出1個表達(dá)量高的柑桔黃龍病菌分泌蛋白408，參與菌毛的組裝。將408蛋白基因構(gòu)建到GV1300植物雙向表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌注射煙草進(jìn)行瞬時表達(dá)，共聚焦顯微鏡觀察表明，在煙草細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)種觀察到綠色熒光，說明408蛋白定位于煙草細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中［9］。序列分析表明，408蛋白除了含有菌毛形成蛋白N端結(jié)構(gòu)域外，其C端還含有兩個高度保守的基序，Motif 1和Motif 2。這兩個高度保守的基序可能與其在宿主細(xì)胞的功能相關(guān)，調(diào)控宿主的相關(guān)代謝或重要通路。但是，408蛋白在宿主體內(nèi)具體的功能和機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

目前，柑桔黃龍病的有效檢測方法包括PCR［17］、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（LAMP）［18］、熒光定量PCR［19］、重組酶聚合酶擴(kuò)增方法（RPA）［20］等診斷技術(shù)。雖然柑桔黃龍病菌相關(guān)蛋白基因的單克隆和多克隆制備也已報道［14，21-23］，但是目前尚無商業(yè)化的蛋白檢測產(chǎn)品。408蛋白是柑桔黃龍病菌的分泌蛋白，是菌毛蛋白的重要組成成分，因此，它的含量是病菌含量的幾千倍甚至是幾萬倍以上。另外，我們通過對408蛋白的免疫原性分析發(fā)現(xiàn)，其N端到C端的免疫原性較好。本研究不但豐富了制備HLB蛋白檢測產(chǎn)品的選擇，同時使用該蛋白制備的單克隆抗體或多克隆抗體產(chǎn)品具有更高的效價和靈敏度。

柑桔黃龍病病菌根據(jù)病原的傳播媒介、序列特征和熱敏性等可分為亞洲種、非洲種和美洲種。根據(jù)408蛋白基因的序列分析，感染海南綠橙的黃龍病菌為亞洲種，與我國其他地區(qū)柑桔類作物上報道的黃龍病菌屬于同一個種［24］。因此，使用本研究制備的抗體不但能用于海南綠橙黃龍病的檢測，也可用于我國其他柑桔類黃龍病的檢測。