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        代謝型谷氨酸受體1阻滯劑LY367385對NMDA所致神經(jīng)元損傷的保護作用

        2019-01-09 11:39:50楊軍蘭趙天智謝云
        關鍵詞:興奮性谷氨酸阻滯劑

        楊軍蘭 趙天智 謝云*

        (1西北婦女兒童醫(yī)院醫(yī)學檢驗中心,陜西 西安 710061; 2空軍軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院神經(jīng)外科,陜西 西安 710038)

        谷氨酸(glutamate, Glu)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的一種興奮性神經(jīng)遞質,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的許多生理和病理過程扮演了重要角色[1]。然而,谷氨酸的過度釋放可以通過與離子型(ionotropic glutamate receptors, iGluRs)和代謝型谷氨酸受體(metabotropic glutamate receptors, mGluRs)的作用,直接引起興奮性神經(jīng)毒性,這一過程也參與了腦外傷、中風、帕金森病等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理過程[2-4]。目前,在代謝型谷氨酸受體家族中,研究最廣泛的是亞型1和5。已有研究表明,激活代謝型谷氨酸受體1(mGluR1)可以導致大鼠癲癇發(fā)作的頻率顯著增加[5-6],并且抑制mGluR1對沙鼠腦缺血損傷有保護作用[7]。此外,mGluR5可以通過與突觸后致密蛋白95(postsynaptic density 95, PSD95)相互作用,從而調控下游的一系列信號分子[8]。然而,mGluR1調控谷氨酸信號轉導的具體機制尚未明確。本實驗利用N-甲基-D-門冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid, NMDA)激活突觸后膜的NMDA受體,以獲取興奮性神經(jīng)元損傷模型,用mGluR1特異性阻滯劑LY367385 [(+)-2-甲基-4-羥基苯甘氨酸]抑制mGluR1的作用,進而了解其在神經(jīng)元興奮性損傷中的具體作用。

        材料與方法

        一、試劑

        孕16 d清潔級SD大鼠,由空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心提供。改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco modified Eagle medium, DMEM)高糖培養(yǎng)基和胎牛血清(Hyclone公司),羥乙基哌嗪乙硫磺酸(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid, HEPES)(Farco公司),PSD95抗體(美國Cell Signaling Technology公司),GluN2B抗體(美國NeuroMab公司),NMDA(美國Sigma公司),細胞裂解液(上海碧云天生物科技研究所),喹啉酸蛋白濃度測定試劑盒(北京博奧森生物技術有限公司),二抗(美國Santa Cruz Biotechnology)。

        二、神經(jīng)元細胞分離及培養(yǎng)

        解剖孕16 d SD大鼠,取出胎鼠,分離腦皮質組織,剪碎,0.25%胰酶37 ℃消化30 min后,加入完全培養(yǎng)液終止消化,離心后去上清,培養(yǎng)液洗滌一次后再次離心,去上清,加2 mL完全培養(yǎng)液輕輕吹打形成細胞懸液,通過200目濾網(wǎng)過濾,以5×105/孔的密度接種于多聚賴氨酸包被的24孔板。完全培養(yǎng)液:DMEM高糖培養(yǎng)基13.4 g/L,碳酸氫鈉2 g/L,青霉素G 100 U/mL,鏈霉素100 μg/mL,HEPES 1.19 g/L,N2添加劑13.4 g/L,胎牛血清10%。神經(jīng)元隨機分為3組:對照組:不做任何處理;NMDA組:10 μM NMDA 處理;NMDA+LY367385組:50 μM LY367385預處理1 h后,再加入10 μM NMDA處理,各組均為5。

        三、細胞活性測定

        將細胞按2×103個/孔接種于96孔培養(yǎng)板,設置6個平行孔及空白對照,分別進行相應處理后每孔加入20 μL甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)溶液(5 mg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,棄去培養(yǎng)基,加入150 μL二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide, DMSO),震蕩15 min,酶標儀490 nm波長下測定各孔吸光度值(optical density, OD),繪制細胞增殖曲線。

        四、細胞培養(yǎng)基乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)含量測定

        神經(jīng)元進行相應處理后,收集上清,依據(jù)試劑盒說明測定LDH含量。

        五、轉移酶介導的三磷酸脫氧鳥苷-生物素刻痕末端標記(transferase-mediated deoxyuridine triphosphate-biotin nick end labeling, TUNEL)法檢測細胞凋亡

        4%多聚甲醛固定細胞,用磷酸緩沖液(phosphate buffer solution tween, PBST)沖洗后按照檢測試劑盒說明書操作,4', 6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)染色觀察細胞核形態(tài),計算平均陽性細胞率,即凋亡指數(shù)(apoptosis index, AI)。

        六、免疫共沉淀

        神經(jīng)元經(jīng)過相應處理后,提取蛋白并與Protein A/G beads和GluN2B抗體或PSD95抗體孵育過夜。樣品經(jīng)Western blot檢測。

        七、蛋白質免疫印跡法(Western blot)檢測

        神經(jīng)元經(jīng)過相應處理后,RIPA法裂解細胞,提取細胞總蛋白,BCA法定量。在12%聚丙烯凝膠中電泳,轉至硝酸纖維素膜,5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,配制適當濃度一抗4 ℃孵育過夜。PBST漂洗后,加入用辣根過氧化物酶標記的相應二抗,室溫封閉2 h,PBST漂洗后加發(fā)光液顯影。

        八、統(tǒng)計學分析

        結 果

        一、mGluR1阻滯劑LY367385對NMDA所致的神經(jīng)元損傷有保護作用

        分別用濃度為1 μM、10 μM、50 μM和100 μM的LY367385處理神經(jīng)元1 h后,向培養(yǎng)基中加入10 μM NMDA造成神經(jīng)元細胞興奮性損傷,24 h后測定細胞活性。同樣方法處理細胞后,收集細胞培養(yǎng)基上清,測定細胞培養(yǎng)基中LDH含量。我們發(fā)現(xiàn),與NMDA損傷組相比,10 μM、50 μM和100 μM LY367385預處理后,細胞活性明顯增加,并且LDH含量明顯降低(P<0.05)。見圖1。為深入探討LY367385的作用,我們選取50 μmol/L的LY367385進行進一步實驗。

        圖1 mGluR1阻滯劑LY367385對NMDA所致的神經(jīng)元損傷有保護作用

        Fig 1 The mGluR1 antagonist LY367385 protects against NMDA-induced neuronal injury

        A: Cell viability; B: LDH release.

        aP< 0.05,vsControl group;bP<0.05,vsNMDA group.

        二、mGluR1阻滯劑LY367385可以抑制NMDA造成的神經(jīng)元凋亡

        用10 μM NMDA 處理神經(jīng)元細胞24 h后,AI值(39.08%±8.36%,P<0.05)與對照組(5.42%±2.59%,P<0.05)相比顯著升高(P<0.05)。50 μM LY367385預處理1 h后,再加入10 μM NMDA處理細胞24 h,AI值(19.96%±8.71%,P<0.05)較NMDA處理組顯著降低(P<0.05)。見圖2。表明NMDA可以造成的神經(jīng)元凋亡,而mGluR1阻滯劑LY367385可以減輕神經(jīng)元凋亡,對NMDA引起的神經(jīng)元損傷有保護作用。

        圖2 mGluR1阻滯劑LY367385可以抑制NMDA造成的神經(jīng)元凋亡

        Fig 2 The mGulR1 antagonist LY367385 inhibits NMDA-induced neuronal apoptosis

        A: TUNEL staining; B: Apoptotic rate.

        aP<0.05,vsControl group;bP<0.05,vsNMDA group.

        圖3 LY367385可以抑制NMDA造成的NR2B-PSD95表達增加

        Fig 3 LY367385 attenuates the formation of NR2B-PSD95 complex

        A: Co-IP of NR2B with PSD95; B: CO-IP of PSD95 with NR2B.

        aP<0.05,vsControl group;bP<0.05,vsNMDA group.

        三、LY367385可以抑制NMDA造成的GluN2B-PSD95表達增加

        應用免疫共沉淀分析GluN2B-PSD95相互作用結果,以進一步分析mGluR1與PSD95在體外是否相互作用。以GluN2B的抗體進行免疫沉淀,在免疫沉淀產(chǎn)物中檢測PSD95,再以PSD95的抗體進行免疫沉淀,在沉淀產(chǎn)物中檢測GluN2B,結果提示,GluN2B與PSD95存在內(nèi)源性的相互作用。見圖3。

        討論

        mGluRs廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng),是一個G蛋白偶聯(lián)受體家族,目前已知有8種亞型。根據(jù)其結構同源性、藥理學特性和傳導通路分成3組,目前研究最為廣泛的主要是第一組mGluRs,包括mGluR1和mGluR5[9]。mGluRs被激活后,通過激活磷脂酶C(phospholipase C, PLC)引起磷脂酰肌醇(phosphoinositide, PI)水解,產(chǎn)生二?;视?diacylglcerol, DAG)和三磷酸肌醇(inositol triphosphate, IP3),從而引起胞質內(nèi)Ca2+增加,產(chǎn)生一系列的生理和病理反應。本實驗觀察了mGluR1特異性阻滯劑LY367385對NMDA引起的神經(jīng)元細胞興奮性損傷的作用,發(fā)現(xiàn)LY367385對減輕NMDA引起的神經(jīng)元細胞凋亡有一定的作用,并且可以影響GluN2B-PSD95復合體的表達。

        突出后致密物(postsynaptic density, PSD)是位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)突出后膜下的高電子密度特化區(qū),主要由谷氨酸受體及相關的支架蛋白及信號通路蛋白組成[10]。PSD95是其中一種主要的蛋白成分,參與了多條信號通路的表達和作用。NMDA受體是iGluRs家族中重要的類型,也是PSD的重要組成部分。NMDA受體可以通過NR2亞基的C末端與PSD95的PDZ1結構域直接連接,形成NMDAR-PSD95復合體。PSD95還可與其他突觸后結構蛋白相連,如GKAP和Shank,后者還可以間接與mGluRs胞內(nèi)末端連接[11-12]。由PSD95連接的這種復雜的突觸后細胞網(wǎng)絡有可能參與和調控了多種胞內(nèi)信號通路的作用。在NMDA損傷的神經(jīng)元中,用LY367385阻斷mGluR1后,GluN2B-PSD95復合體的表達顯著減少。因此,mGluR1可能通過與突觸后致密物質PSD95的相互作用影響NMDA受體功能,從而減輕細胞興奮性損傷,發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

        LY367385對抗NMDA所致的神經(jīng)元損傷的作用表明,mGluR1在神經(jīng)系統(tǒng)興奮性損傷中起了重要作用,mGluR1的阻滯劑有望成為新的神經(jīng)保護劑。

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