楊軍蘭 趙天智 謝云*

(1西北婦女兒童醫(yī)院醫(yī)學檢驗中心，陜西 西安 710061; 2空軍軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 710038)

谷氨酸(glutamate, Glu)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的一種興奮性神經(jīng)遞質，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的許多生理和病理過程扮演了重要角色[1]。然而，谷氨酸的過度釋放可以通過與離子型(ionotropic glutamate receptors, iGluRs)和代謝型谷氨酸受體(metabotropic glutamate receptors, mGluRs)的作用，直接引起興奮性神經(jīng)毒性，這一過程也參與了腦外傷、中風、帕金森病等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理過程[2-4]。目前，在代謝型谷氨酸受體家族中，研究最廣泛的是亞型1和5。已有研究表明，激活代謝型谷氨酸受體1(mGluR1)可以導致大鼠癲癇發(fā)作的頻率顯著增加[5-6]，并且抑制mGluR1對沙鼠腦缺血損傷有保護作用[7]。此外，mGluR5可以通過與突觸后致密蛋白95(postsynaptic density 95, PSD95)相互作用，從而調控下游的一系列信號分子[8]。然而，mGluR1調控谷氨酸信號轉導的具體機制尚未明確。本實驗利用N-甲基-D-門冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid, NMDA)激活突觸后膜的NMDA受體，以獲取興奮性神經(jīng)元損傷模型，用mGluR1特異性阻滯劑LY367385 [(+)-2-甲基-4-羥基苯甘氨酸]抑制mGluR1的作用，進而了解其在神經(jīng)元興奮性損傷中的具體作用。

材料與方法

一、試劑

孕16 d清潔級SD大鼠，由空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心提供。改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco modified Eagle medium, DMEM)高糖培養(yǎng)基和胎牛血清(Hyclone公司)，羥乙基哌嗪乙硫磺酸(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid, HEPES)(Farco公司)，PSD95抗體(美國Cell Signaling Technology公司)，GluN2B抗體(美國NeuroMab公司)，NMDA(美國Sigma公司)，細胞裂解液(上海碧云天生物科技研究所)，喹啉酸蛋白濃度測定試劑盒(北京博奧森生物技術有限公司)，二抗(美國Santa Cruz Biotechnology)。

二、神經(jīng)元細胞分離及培養(yǎng)

解剖孕16 d SD大鼠，取出胎鼠，分離腦皮質組織，剪碎，0.25%胰酶37 ℃消化30 min后，加入完全培養(yǎng)液終止消化，離心后去上清，培養(yǎng)液洗滌一次后再次離心，去上清，加2 mL完全培養(yǎng)液輕輕吹打形成細胞懸液，通過200目濾網(wǎng)過濾，以5×105/孔的密度接種于多聚賴氨酸包被的24孔板。完全培養(yǎng)液：DMEM高糖培養(yǎng)基13.4 g/L，碳酸氫鈉2 g/L，青霉素G 100 U/mL，鏈霉素100 μg/mL，HEPES 1.19 g/L，N2添加劑13.4 g/L，胎牛血清10%。神經(jīng)元隨機分為3組：對照組：不做任何處理；NMDA組：10 μM NMDA 處理；NMDA+LY367385組：50 μM LY367385預處理1 h后，再加入10 μM NMDA處理，各組均為5。

三、細胞活性測定

將細胞按2×103個/孔接種于96孔培養(yǎng)板，設置6個平行孔及空白對照，分別進行相應處理后每孔加入20 μL甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)溶液(5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去培養(yǎng)基，加入150 μL二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide, DMSO)，震蕩15 min，酶標儀490 nm波長下測定各孔吸光度值(optical density, OD)，繪制細胞增殖曲線。

四、細胞培養(yǎng)基乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)含量測定

神經(jīng)元進行相應處理后，收集上清，依據(jù)試劑盒說明測定LDH含量。

五、轉移酶介導的三磷酸脫氧鳥苷-生物素刻痕末端標記(transferase-mediated deoxyuridine triphosphate-biotin nick end labeling, TUNEL)法檢測細胞凋亡

4%多聚甲醛固定細胞，用磷酸緩沖液(phosphate buffer solution tween, PBST)沖洗后按照檢測試劑盒說明書操作，4', 6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)染色觀察細胞核形態(tài)，計算平均陽性細胞率，即凋亡指數(shù)(apoptosis index, AI)。

六、免疫共沉淀

神經(jīng)元經(jīng)過相應處理后，提取蛋白并與Protein A/G beads和GluN2B抗體或PSD95抗體孵育過夜。樣品經(jīng)Western blot檢測。

七、蛋白質免疫印跡法(Western blot)檢測

神經(jīng)元經(jīng)過相應處理后，RIPA法裂解細胞，提取細胞總蛋白，BCA法定量。在12%聚丙烯凝膠中電泳，轉至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，配制適當濃度一抗4 ℃孵育過夜。PBST漂洗后，加入用辣根過氧化物酶標記的相應二抗，室溫封閉2 h，PBST漂洗后加發(fā)光液顯影。

八、統(tǒng)計學分析

結 果

一、mGluR1阻滯劑LY367385對NMDA所致的神經(jīng)元損傷有保護作用

分別用濃度為1 μM、10 μM、50 μM和100 μM的LY367385處理神經(jīng)元1 h后，向培養(yǎng)基中加入10 μM NMDA造成神經(jīng)元細胞興奮性損傷，24 h后測定細胞活性。同樣方法處理細胞后，收集細胞培養(yǎng)基上清，測定細胞培養(yǎng)基中LDH含量。我們發(fā)現(xiàn)，與NMDA損傷組相比，10 μM、50 μM和100 μM LY367385預處理后，細胞活性明顯增加，并且LDH含量明顯降低(P<0.05)。見圖1。為深入探討LY367385的作用，我們選取50 μmol/L的LY367385進行進一步實驗。

圖1 mGluR1阻滯劑LY367385對NMDA所致的神經(jīng)元損傷有保護作用

Fig 1 The mGluR1 antagonist LY367385 protects against NMDA-induced neuronal injury

A: Cell viability; B: LDH release.

aP< 0.05,vsControl group;bP<0.05,vsNMDA group.

二、mGluR1阻滯劑LY367385可以抑制NMDA造成的神經(jīng)元凋亡

用10 μM NMDA 處理神經(jīng)元細胞24 h后，AI值(39.08%±8.36%,P<0.05)與對照組(5.42%±2.59%,P<0.05)相比顯著升高(P<0.05)。50 μM LY367385預處理1 h后，再加入10 μM NMDA處理細胞24 h，AI值(19.96%±8.71%,P<0.05)較NMDA處理組顯著降低(P<0.05)。見圖2。表明NMDA可以造成的神經(jīng)元凋亡，而mGluR1阻滯劑LY367385可以減輕神經(jīng)元凋亡，對NMDA引起的神經(jīng)元損傷有保護作用。

圖2 mGluR1阻滯劑LY367385可以抑制NMDA造成的神經(jīng)元凋亡

Fig 2 The mGulR1 antagonist LY367385 inhibits NMDA-induced neuronal apoptosis

A: TUNEL staining; B: Apoptotic rate.

aP<0.05,vsControl group;bP<0.05,vsNMDA group.

圖3 LY367385可以抑制NMDA造成的NR2B-PSD95表達增加

Fig 3 LY367385 attenuates the formation of NR2B-PSD95 complex

A: Co-IP of NR2B with PSD95; B: CO-IP of PSD95 with NR2B.

aP<0.05,vsControl group;bP<0.05,vsNMDA group.

三、LY367385可以抑制NMDA造成的GluN2B-PSD95表達增加

應用免疫共沉淀分析GluN2B-PSD95相互作用結果，以進一步分析mGluR1與PSD95在體外是否相互作用。以GluN2B的抗體進行免疫沉淀，在免疫沉淀產(chǎn)物中檢測PSD95，再以PSD95的抗體進行免疫沉淀，在沉淀產(chǎn)物中檢測GluN2B，結果提示，GluN2B與PSD95存在內(nèi)源性的相互作用。見圖3。

討論

mGluRs廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，是一個G蛋白偶聯(lián)受體家族，目前已知有8種亞型。根據(jù)其結構同源性、藥理學特性和傳導通路分成3組，目前研究最為廣泛的主要是第一組mGluRs，包括mGluR1和mGluR5[9]。mGluRs被激活后，通過激活磷脂酶C(phospholipase C, PLC)引起磷脂酰肌醇(phosphoinositide, PI)水解，產(chǎn)生二?；视?diacylglcerol, DAG)和三磷酸肌醇(inositol triphosphate, IP3)，從而引起胞質內(nèi)Ca2+增加，產(chǎn)生一系列的生理和病理反應。本實驗觀察了mGluR1特異性阻滯劑LY367385對NMDA引起的神經(jīng)元細胞興奮性損傷的作用，發(fā)現(xiàn)LY367385對減輕NMDA引起的神經(jīng)元細胞凋亡有一定的作用，并且可以影響GluN2B-PSD95復合體的表達。

突出后致密物(postsynaptic density, PSD)是位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)突出后膜下的高電子密度特化區(qū)，主要由谷氨酸受體及相關的支架蛋白及信號通路蛋白組成[10]。PSD95是其中一種主要的蛋白成分，參與了多條信號通路的表達和作用。NMDA受體是iGluRs家族中重要的類型，也是PSD的重要組成部分。NMDA受體可以通過NR2亞基的C末端與PSD95的PDZ1結構域直接連接，形成NMDAR-PSD95復合體。PSD95還可與其他突觸后結構蛋白相連，如GKAP和Shank，后者還可以間接與mGluRs胞內(nèi)末端連接[11-12]。由PSD95連接的這種復雜的突觸后細胞網(wǎng)絡有可能參與和調控了多種胞內(nèi)信號通路的作用。在NMDA損傷的神經(jīng)元中，用LY367385阻斷mGluR1后，GluN2B-PSD95復合體的表達顯著減少。因此，mGluR1可能通過與突觸后致密物質PSD95的相互作用影響NMDA受體功能，從而減輕細胞興奮性損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

LY367385對抗NMDA所致的神經(jīng)元損傷的作用表明，mGluR1在神經(jīng)系統(tǒng)興奮性損傷中起了重要作用，mGluR1的阻滯劑有望成為新的神經(jīng)保護劑。