魏禮洲 劉衛(wèi)平 伊西才 黑悅

(空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安710032)

近年來我們和其他相關研究發(fā)現(xiàn)永久性雙側頸總動脈結扎模型(bilateral common carotid artery occlusion, BCCAO)可以很好的模仿血管性癡呆(vascular dementia, VaD)相關認知功能障礙以及慢性全腦缺血[1]。而海馬區(qū)域椎體神經(jīng)元是VaD引起的認知功能障礙重要靶點，而其中γ氨基丁酸能系統(tǒng)(GABAergic system)的選擇性調控對認知改善有十分積極的作用。抑制性神經(jīng)元突觸中GABA B 型受體1(GABA type B receptor 1, GABABR1)的表達是該系統(tǒng)的重要組成部分，在GABA神經(jīng)遞質的合成和功能發(fā)揮中扮演重要角色[2-4]，近年研究發(fā)現(xiàn)對該受體的調控能夠引起細胞外GABA水平和認知功能的改變，可能參與了血管性癡呆的病理生理過程，但尚未有相關文章探究該受體表達的時空變化。

本實驗采用雙側頸總動脈結扎制作血管性癡呆大鼠模型，在3 d、14 d、28 d 三個時間點使用免疫印跡分析整體海馬中GABABR1蛋白表達，用間接免疫熒光分析大鼠海馬CA1、CA3和DG區(qū)域空間表達變化以此闡明GABABR1表達的時空變化，為針對該受體的進一步功能研究奠定基礎。

材料與方法

一、實驗動物和分組

全部健康成年Sprague Dawley(SD)大鼠(雄性，230～250 g)50只，由空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心提供。實驗動物隨機分為正常組(n=20)和模型組(n=30)。遇到有造模失敗或死亡，則將另外補充。

二、大鼠血管性癡呆模型的制作

造模前適應性喂養(yǎng)1 w，術前12 h禁食，采用永久性雙側頸總動脈結扎制作大鼠血管性癡呆模型。大鼠腹腔麻醉(10%水合氯醛，3 mg/kg)，仰臥位固定，于頸部正中做1.5 cm切口，暴露并分離雙側頸總動脈，注意盡量不牽扯迷走神經(jīng)，取7號線于頸總動脈近遠心端做2處方結，做永久性結扎。術后6 h以Longa五級四分法評分為1～3分者為模型建立成功。

三、大鼠腦組織標本制備及GABABR1間接免疫熒光染色

模型建立后第28 d取大鼠(模型組、假手術組各6只)，用200 mL生理鹽水灌注后用4%多聚甲醛灌注固定。常規(guī)石蠟包埋，冠狀切片(厚度為2 mm)。石蠟切片常規(guī)脫蠟止水，pH=6.0的檸檬酸修復液進行抗原修復；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution, PBS)漂洗3次，每次6 min；加入0.3% H2O2溶液封閉內源性過氧化酶15 min；PBS漂洗3次，每次6 min；加入驢血清封閉1 h后甩去血清加入兔抗GABABR1(1 ∶400, Abcam, 美國)抗體，在4 ℃冰箱中孵育過夜,洗脫。使用山羊抗兔Alexor Fluor 488-結合的二抗(1 ∶1 000, 美國)以及4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4', 6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)染色液(1 ∶1 000, 美國)，室溫孵育2 h。分兩人在熒光顯微鏡下觀察，規(guī)劃海馬的相應劃分，在每只大鼠隨機觀察10個切片，隨后分別進行統(tǒng)計，并取平均值。

四、大鼠海馬區(qū)域GABABR1的Western blot檢測

各組大鼠(模型組、假手術組各6只)麻醉狀態(tài)下經(jīng)左心室持續(xù)灌注200 mL 0.01 moL/L PBS后，在冰上斷頭輕柔分離雙側大鼠海馬組織加入強效組織裂解液1 mL提取蛋白，進行蛋白定量(西安鼎國)。配制10%十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis, SDS-PAGE)，按80 μg總蛋白上樣量上樣，5%濃縮膠、10%分離膠電泳后，100 V電壓2 h將蛋白轉移到硝酸纖維素膜(nitrocellulose filter membrane)上，麗春紅染色預染條帶，1×三乙醇胺緩沖鹽水溶液(tris buffered saline and tween, TBST)洗3×5 min，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，1×TBST洗3×5 min。而后使用GABABR1(1 ∶400, Abcam, 美國)抗體在4 ℃冰箱中孵育過夜，加入二抗后辣根過氧化物酶顯色。使用計算機-熒光掃描儀系統(tǒng)掃描底片而后用Image J統(tǒng)計分析。

五、統(tǒng)計分析

結 果

一、 免疫印跡實驗

血管性癡呆模型的海馬CA1區(qū)GABABRs蛋白表達水平也呈現(xiàn)相應的雙向變化，實驗組相比假手術組，GABABR1 蛋白表達水平在3 d顯著下降，并與28 d有部分回升(P<0.05, 3 dvs假手術組,P<0.05, 28 dvs3 d)。

二、免疫熒光實驗

與免疫印跡結果相對應，大鼠海馬CA1區(qū)GABABRs 熒光表達水平也呈現(xiàn)雙向變化。在熒光鏡下計數(shù)至少10個以上的高倍視野進行統(tǒng)計分析(如圖2所示)。模型組GABABR1陽性細胞相比假手術組，在3 d時間顯著下降(P<0.05)，而后與28 d時間點相比3 d有所回升(P<0.05)，而GABABR1的表達在CA3和DG區(qū)域并無統(tǒng)計學差異。

圖1 各個時間點海馬整體GABABRs蛋白表達水平變化

Fig 1 GABABR1 relative protein levels of the whole hippocampal area at different time points

A: The Western blot of the GABABR1 protein and β-actin; B: The statistical analysis of the bands.

aP<0.05,vsModel group;bP<0.05,vsModel group 28 d.

N=6 per group.

圖2 GABABRs各個時間點間接免疫熒光染色

Fig 2 Immunofluorescence staining results of GABABR1 at different time points

A: Representative images of GABABR1 positive cells in the hippocampal CA1 subareas of both sham and model group; B: The quantification analysis of the immunofluorescence staining. No significant difference was found in CA3 and DG subareas in the hippocampus.

aP<0.05,vsModel group;bP<0.05,vsModel group 28 d.

N=6 in both groups. Scale bar=40 μm.

討論

血管性癡呆為老年癡呆的主要類型之一，其認知障礙由腦組織血液循環(huán)障礙引起[5]，而雙側頸總動脈結扎(BCCAO)手術能夠很好復制疾病機制，引起血腦屏障破壞、認知功能下降以及神經(jīng)元損傷等[6]，是近年來使用頻率最多且被廣泛認可的血管性癡呆動物模型之一[5,7-8]。相比于大鼠的前額的皮層區(qū)域，海馬與大鼠的長期記憶以及長時程增強(long-term potention, LTP)相關[9]，其CA1區(qū)域的神經(jīng)元凋亡已被眾多研究所證實[10-12]，并且CA1區(qū)域的神經(jīng)元數(shù)量可能與大鼠認知水平和手術死亡率直接相關，其中GABA能神經(jīng)元占有重要的位置。GABA能系統(tǒng)缺陷在阿爾茲海默氏病，癲癇以及慢性缺血性腦損傷中都有報道。

GABABR1在大腦發(fā)育的各個階段均扮演重要位置，海馬區(qū)域細胞發(fā)育早期，作為GABA能系統(tǒng)的最后功能組分，部分決定了神經(jīng)元分化等一系列過程。有研究表明，血管性癡呆模型中該受體在海馬CA1區(qū)域表達明顯降低，但并未系統(tǒng)分析其時空表達變化。本實驗發(fā)現(xiàn)其在3 d時下調，并于28 d時有所回升。此種時間依賴性的動態(tài)變化，說明急性期的應激反應(如活性氧、炎癥反應等)極有可能對受體表達也有重要的調控作用[13]。血管性癡呆的慢性期，隨著應激反應減輕和神經(jīng)網(wǎng)絡的重塑，GABABR1有部分上調。此外，該受體在認知過程的作用近年來也有報道。激活該受體可引起環(huán)化核苷酸門控陽離子通道蛋白HCN1/HCN2的表達失衡，從而對認知起到積極作用；定位方面，其在海馬區(qū)域可能主要表達于小清蛋白(parvalbumin, PV)中間神經(jīng)元中，并且用相應的抑制/激動劑能夠起到認知調控作[14]。

本實驗通過建立BCCAO的大鼠血管性癡呆模型，在3 d、14 d、28 d 三個時間點使用免疫印跡和間接免疫熒光分析了大鼠海馬GABABR1在不同時間(3 d、14 d、28 d)和海馬不同位置(CA1、CA3和DG)表達的變化，發(fā)現(xiàn)該受體在海馬整體水平在造模后3 d迅速下降至低點，而后緩慢增高并在28 d時候相比急性期(3 d)有所回升，熒光染色發(fā)現(xiàn)該現(xiàn)象可能是由于CA1區(qū)域的GABABR1表達變化所致，以上現(xiàn)象并未在CA3和DG區(qū)域均無顯著性差異。本實驗為進一步探究該受體的功能奠定了基礎。