倪志遠，蔣桃珍

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

疫苗是預(yù)防和控制傳染病的最有效和最經(jīng)濟的技術(shù)手段。通過采用疫苗進行免疫接種，全球已經(jīng)消滅了天花、牛瘟等重要人和動物傳染病。DNA重組技術(shù)的出現(xiàn)和快速發(fā)展，為基因工程疫苗的研究提供了良好的技術(shù)平臺。目前以細(xì)菌和病毒為載體，構(gòu)建表達特定目的蛋白的活載體疫苗已成為疫苗研究的熱點之一。

1980年Schaffnerr研究發(fā)現(xiàn)SV40 DNA可以直接通過細(xì)菌轉(zhuǎn)移到哺乳動物細(xì)胞，這一發(fā)現(xiàn)為細(xì)菌活載體疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)[1]。細(xì)菌載體疫苗是利用基因工程技術(shù)將目的DNA質(zhì)?；虮Ｗo性抗原核酸片段插入到細(xì)菌基因組或質(zhì)粒，通過細(xì)菌自然感染將其運輸?shù)桨屑?xì)胞、組織和器官后，誘導(dǎo)機體對特定病原產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答反應(yīng)。利用一些細(xì)菌如沙門菌、乳酸桿菌等構(gòu)建的活載體活疫苗，可以通過口服和鼻內(nèi)等途徑進行接種，從而誘導(dǎo)粘膜免疫，這對于通過呼吸道感染或腸道感染疾病的預(yù)防是非常有效的[2]。此外，相比病毒活載體疫苗，細(xì)菌活載體疫苗的生產(chǎn)成本低，生產(chǎn)工藝簡單且利于純化，這也是近些年細(xì)菌活載體疫苗研究成為熱點的重要原因之一。

1 細(xì)菌活載體疫苗的構(gòu)建及表達系統(tǒng)的類別

目前，細(xì)菌活載體疫苗構(gòu)建的方式主要分為兩種，一種是將外源基因整合到細(xì)菌染色體，另一種是將外源基因整合到細(xì)菌質(zhì)粒中。染色體整合是將細(xì)菌某段非必須基因組敲除后替換為目的基因，或直接插入表達外源抗原的表達盒，這種構(gòu)建方式可以保證異源基因的穩(wěn)定性[3]。另一種方式是將外源基因插入到細(xì)菌質(zhì)粒中，利用細(xì)菌質(zhì)粒的表達元件表達目的抗原，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。一般而言，由構(gòu)建的載體細(xì)菌直接表達外源基因從而刺激宿主免疫反應(yīng)的載體系統(tǒng)稱為原核表達系統(tǒng)，而由構(gòu)建的載體細(xì)菌將外源基因傳遞至宿主細(xì)胞，由宿主細(xì)胞表達外源基因從而刺激宿主免疫反應(yīng)的稱為真核表達系統(tǒng)[4]。

1.1 原核表達系統(tǒng) 在細(xì)菌原核表達系統(tǒng)中，細(xì)菌自身產(chǎn)生外源抗原運輸至抗原提呈細(xì)胞，外源抗原可以在細(xì)菌內(nèi)合成，也可以通過表面展示和分泌系統(tǒng)運出細(xì)菌[5 ]。細(xì)菌表達外源抗原要克服基因組穩(wěn)定性和免疫原性兩個方面的挑戰(zhàn)。在防止目的抗原丟失、無質(zhì)粒細(xì)菌過度生長的眾多構(gòu)建策略中，平衡致死系統(tǒng)是最為經(jīng)典的方法：即敲除或突變細(xì)菌活載體的復(fù)制必須基因，使攜帶的質(zhì)粒能夠編碼細(xì)菌復(fù)制必須蛋白，導(dǎo)致無質(zhì)?；蛏儋|(zhì)粒的子代細(xì)菌無法正常代謝而死亡。例如弱毒鼠傷寒沙門氏菌的asd基因編碼β-半醛脫氫酶，該酶不僅與氨基酸的合成有關(guān)，還介導(dǎo)了細(xì)胞壁的合成，因此敲除細(xì)菌asd基因后，構(gòu)建含有編碼asd基因的質(zhì)粒，這樣存活的子代鼠傷寒沙門氏菌就都攜帶質(zhì)粒[6],確保外源基因的穩(wěn)定性和有效表達。

合適的啟動子是調(diào)控表達效率、誘導(dǎo)足夠免疫應(yīng)答的關(guān)鍵點。Hohmann發(fā)現(xiàn)利用組成型啟動子構(gòu)建的鼠傷寒沙門氏菌載體雖然能高水平的表達外源抗原，但表達的抗原不能誘導(dǎo)產(chǎn)生足夠的免疫保護；而誘導(dǎo)型啟動子Ppagc使細(xì)菌被巨噬細(xì)胞吞噬后才可表達大量抗原，并誘導(dǎo)產(chǎn)生足夠的免疫保護[7]。分析其原因，是因為組成型啟動子在表達大量外源抗原時，增加了細(xì)菌代謝負(fù)擔(dān)從而降低了免疫原性。因此構(gòu)建的細(xì)菌的特征應(yīng)是在最初免疫時盡可能減少外源抗原的表達量，而在細(xì)菌定植和誘發(fā)免疫應(yīng)答時最大化表達外源抗原[8]。

細(xì)菌分泌系統(tǒng)和表面展示也是較為廣泛使用的兩種技術(shù)手段。Kang和Curtiss將肺炎克雷伯菌PspA基因與沙門氏菌β-lactamase的分泌信號整合,構(gòu)建了可以分泌PspA的沙門氏菌活載體疫苗，該菌株誘導(dǎo)的體液免疫比非分泌型PspA的菌株強1萬倍[9]。細(xì)菌表面展示是用基因重組方法將外源蛋白表達于細(xì)菌表面，將外源抗原基因與編碼外膜蛋白的基因如OmpA，LamB融合，產(chǎn)生的融合蛋白定位在細(xì)胞膜外刺激并增強機體免疫應(yīng)答。此外，將刺激免疫反應(yīng)的一些細(xì)胞因子和外源抗原共表達也可提高細(xì)菌活載體的免疫原性。

1.2 真核表達系統(tǒng) 具有侵襲性的載體細(xì)菌進入宿主靶細(xì)胞后菌體裂解，質(zhì)粒釋放到胞質(zhì)內(nèi)，釋放的質(zhì)粒通過真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯機制表達目的蛋白并經(jīng)修飾、折疊，從而刺激機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。該類細(xì)菌載體疫苗的作用機理類似DNA疫苗，但克服了DNA疫苗接種劑量大，免疫原性差，質(zhì)粒生產(chǎn)成本較高等缺點[10]，而且細(xì)菌活載體還可以特異性的被抗原提呈細(xì)胞識別，加工，誘導(dǎo)比DNA疫苗作用更持久有效的免疫保護[11]。鼠傷寒沙門氏菌、志賀氏菌、產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌等均可以將其攜帶的真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)運至真核細(xì)胞內(nèi)。但到目前為止，通過細(xì)菌活載體運輸質(zhì)粒的機制尚未研究清楚，推測可能與細(xì)菌侵染特性有關(guān)。

細(xì)菌載體質(zhì)粒一般由真核表達框和載體骨架兩個部分組成，表達框包含啟動子、多克隆位點、5'UTR和Poly A；骨架包含復(fù)制起始位點Ori、抗生素抗性基因或其他選擇性標(biāo)志基因?？赏ㄟ^優(yōu)化真核表達框元件和精簡載體骨架來提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性和安全性[12]。真核表達系統(tǒng)中，能在宿主細(xì)胞內(nèi)高效表達蛋白的啟動子起著至關(guān)重要的作用，CMV、SV40和鼠白血病病毒啟動子是真核表達常用的啟動子。Zhi-Li Xu研究發(fā)現(xiàn)CMV增強子，啟動子和含有intron A的5'UTR聯(lián)用可以在體內(nèi)和體外誘導(dǎo)高水平的基因表達[13]；Garg研究發(fā)現(xiàn)CMV增強子與β-actin啟動子，WPRE等元件聯(lián)合組成雜合啟動子能表達更高水平的HA蛋白，誘發(fā)強烈的免疫保護反應(yīng)[14]。一些非病毒啟動子也能有效表達抗原基因，Kos利用膠原啟動子在皮膚細(xì)胞特異性表達IL-12[15]。大腸桿菌Ori ColE1作為pUC載體的OriV，也一直是DNA疫苗起始位點的良好選擇，可以使質(zhì)粒在細(xì)菌內(nèi)有500～700的拷貝數(shù)[16]。Poly A對基因的表達也有很大的影響，DNA疫苗常使用的Poly A序列包括SV40,兔β-globin和牛生長激素的Poly A序列[17]。由于使用抗性基因作為選擇標(biāo)志可能會導(dǎo)致抗性基因的傳播和宿主微生物種群的改變，歐洲藥品管理局(MEA)推薦選擇抗生素抗性基因以外的標(biāo)志基因來降低生物安全風(fēng)險，目前已有營養(yǎng)缺陷性菌株，毒素-抗毒素系統(tǒng)，RNA標(biāo)記和ORT 系統(tǒng)來用于替代抗生素抗性標(biāo)志基因，并取得了較好的進展[18]。

2 細(xì)菌活載體疫苗研究進展

用于載體疫苗研究的細(xì)菌有多種，主要包括沙門氏菌、產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌、乳酸菌、百日咳波氏桿菌、枯草芽孢桿菌等，利用這些細(xì)菌構(gòu)建的多種載體疫苗已進入臨床試驗階段，其中用百日咳波氏桿菌構(gòu)建的表達EV71病毒SP70的載體疫苗，用干酪乳酸桿菌以及產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌表達的人乳頭瘤病毒E7蛋白的載體疫苗等已進入了一期臨床實驗。

2.1 沙門氏菌活載體疫苗 沙門氏菌是兼性胞內(nèi)寄生菌，屬于革蘭氏陰性菌，因其可通過化學(xué)突變或基因工程方法進行減毒或致弱，是目前研究最多的細(xì)菌載體之一。減毒沙門氏菌作為活載體時，以口服或鼻腔途徑進行免疫，可通過自然感染模式將目的抗原蛋白或攜帶的目的抗原質(zhì)粒運送到宿主細(xì)胞內(nèi)，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。Xu利用亞硝基胍誘導(dǎo)傷寒沙門氏菌非定點突變得到了Ty21a血清型變異株，并構(gòu)建了表達痢疾志賀菌O-Ps的載體疫苗，疫苗通過腹膜內(nèi)接種小鼠后，可以檢測到抗痢疾志賀菌的IgG，攻毒后小鼠存活率達100%[19]，該疫苗已進入臨床前實驗；Bumann 利用Ty21a株構(gòu)建了表達銅綠假單胞菌OprF-OprI的載體疫苗，人通過口服或鼻腔接種后可檢測到高水平抗銅綠假單胞菌的IgG和IgA[20]，該疫苗已進入一期臨床實驗；Aebischer利用Ty21a株構(gòu)建了表達幽門螺桿菌抗原的載體疫苗，通過口服接種后有69%志愿者檢測到特異性輔助T細(xì)胞，該疫苗已進入一期臨床實驗[21]。

在所有細(xì)菌活載體疫苗研究中，沙門氏菌的研究是最廣泛深入的。國內(nèi)學(xué)者構(gòu)建了多種用于動物疫病預(yù)防的沙門氏菌活載體疫苗。陳凱構(gòu)建了表達腸炎沙門氏菌SEF14菌毛的重組減毒禽傷寒沙門氏菌SG9R(pYA3342-sef)，雞經(jīng)兩次免疫后可檢測到高水平的IgG,攻毒后免疫組雞組織病變顯著低于對照組[22]。鮮思美將鴨瘟病毒(DEV)gB/NP28基因插入到真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1后轉(zhuǎn)化到減毒沙門氏菌，口服免疫雛鴨后，用強毒攻擊可提供75%以上的保護[23]。王君耀構(gòu)建了表達旋毛蟲43 ku ES蛋白的重組減毒沙門氏菌，口服免疫小鼠后可刺激脾臟和腸系膜淋巴結(jié)的增殖，產(chǎn)生較高水平的抗體和細(xì)胞因子，攻毒后免疫小鼠體內(nèi)旋毛蟲數(shù)量顯著減少[24]。

2.2 乳酸菌活載體疫苗 乳酸菌是一種非致病菌，廣泛用于食品工業(yè)，是目前認(rèn)為最安全的細(xì)菌載體之一。許多研究表明乳酸球菌可以將DNA質(zhì)粒遞送到宿主細(xì)胞內(nèi)[25]。也有研究報道，將金黃色葡萄球菌的纖連蛋白結(jié)合蛋白A基因或產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌的內(nèi)化蛋白A基因整合到乳酸菌的基因組后，可增加其對宿主細(xì)胞的侵襲性[26]，同時可提高其遞送DNA的能力。此外，也有研究表明某些種類的乳酸桿菌顯示出與巨噬細(xì)胞活化有關(guān)的非特異性佐劑效應(yīng)[27]。Adachi 采用干酪乳酸桿菌構(gòu)建的表達HPV E7蛋白的載體疫苗通過口服、皮內(nèi)和肌肉途徑免疫小鼠后利用流式細(xì)胞技術(shù)和ELISPOT等技術(shù)進行分析，發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)產(chǎn)生有效的粘膜免疫應(yīng)答[28]。Ramasamy 利用乳酸乳球菌構(gòu)建的表達惡性瘧原蟲MSA2的載體疫苗，通過口服和鼻腔途徑接種兔后，利用IFA檢測到有效的免疫反應(yīng)，其中口服后血清中的抗體水平更高[29]。但乳酸菌在體內(nèi)定植時間較短，無法誘發(fā)足夠穩(wěn)定的免疫保護，基礎(chǔ)研究不足等問題也制約著乳酸菌活載體疫苗的研究進程[30]。

3 展 望

通過近二十年的研究，細(xì)菌活載體疫苗已經(jīng)取得了一定的進展，研制的許多細(xì)菌載體疫苗已被臨床試驗證明有效。此外，細(xì)菌活載體作為DNA疫苗、腫瘤疫苗或某些細(xì)胞因子的遞呈系統(tǒng)有著明顯優(yōu)勢，沙門氏菌等腸道菌群對腸粘膜的樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞有天然的趨向性，可以誘導(dǎo)包括粘膜免疫在內(nèi)的較為廣泛的免疫應(yīng)答[31]。同時細(xì)菌載體某些成分如革蘭氏陰性菌的脂多糖和革蘭氏陽性菌的脂磷壁酸能夠刺激機體產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子，使之發(fā)揮佐劑的作用，誘導(dǎo)產(chǎn)生較強的免疫應(yīng)答[32]。

細(xì)菌活載體疫苗研究目前所面臨的挑戰(zhàn)主要包括兩個方面：一方面是如何使其誘發(fā)更持久有效的免疫保護，在保證免疫效力的同時如何提高活載體的穩(wěn)定性[33]；另一方面是臨床應(yīng)用的安全性，如其對環(huán)境潛在的安全隱患，毒力返強可能對宿主造成的健康危害，細(xì)菌耐藥性的公共衛(wèi)生風(fēng)險等問題[34]。與病毒活載體疫苗不同，雖然很多細(xì)菌活載體疫苗已進入臨床試驗階段，但是至今仍然沒有商品化的細(xì)菌活載體疫苗。因此，篩選更合適的細(xì)菌活載體，構(gòu)建更安全的表達系統(tǒng)，研發(fā)新的免疫策略，將是今后可商品化應(yīng)用的細(xì)菌活載體疫苗研究的重點方向。