張吉

（1.湖北博大生物股份有限公司，湖北 黃石 435000；2.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，江西 南昌 330200）

丁酸梭菌（Clostridium butyricum），全名丁酸梭狀芽孢桿菌（Clostridium butyrate bacillus）， 又 名丁 酸菌（Butylic acid bacteria）、 酪酸菌（Butyric acid bacteria）、酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）、 宮 入菌（Clostridium butyricum Miyairi）， 為芽孢桿菌科（Bacillaceae）、梭菌屬（Clostridium）[1]嚴(yán)格厭氧的革蘭氏陽(yáng)性產(chǎn)芽孢短桿菌，菌體中常有圓形或卵圓（橢圓）形芽孢，偏心或次端生，可抵御不良環(huán)境，廣泛分布于人和動(dòng)物的腸道、糞便，奶酪、酸奶、酒窖泥，以及土壤、樹(shù)葉等自然環(huán)境中[2]，細(xì)菌學(xué)分類(lèi)屬于厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、梭菌綱（Clostridia）、梭菌目（Clostridiales）、芽孢桿菌科（Bacillaceae）、梭菌屬（Clostridium）[3]。

1 丁酸梭菌的發(fā)現(xiàn)、發(fā)展簡(jiǎn)史

1.1 丁酸梭菌在國(guó)外的發(fā)現(xiàn)、分離與產(chǎn)業(yè)化

丁酸梭菌之所以又名宮入菌，是因?yàn)槎∷崴缶钕扔扇毡厩~醫(yī)科大學(xué)宮入近治博士首先于1933年發(fā)現(xiàn)并報(bào)道的[4]。俄羅斯微生物研究所的Kingi miyairi博士于1935年從健康人的糞便與土壤中分離出丁酸梭菌，并從丁酸梭菌厭氧培養(yǎng)的過(guò)濾物中發(fā)現(xiàn)含有乳酸、丁酸等短鏈脂肪酸[3]。這些短鏈脂肪酸具有較強(qiáng)的調(diào)理腸道功能，也就是整腸作用，即能夠調(diào)整腸道液體的分泌（抑制腸液的過(guò)量分泌，促進(jìn)腸液的吸收），減少腸內(nèi)的水分含量，也就相應(yīng)地減少了大便中的水分，從而抑制腹瀉；同時(shí)還能夠促進(jìn)腸道中如雙歧桿菌、乳桿菌等益生菌的生長(zhǎng)，抑制腸道中的致病菌的生長(zhǎng)，維持腸道菌群平衡，提高機(jī)體免疫功能，增進(jìn)動(dòng)物健康，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。日本于1944年成功研制出可用于臨床的丁酸梭菌制劑，該制劑克服了雙歧桿菌、乳酸菌等益生菌制劑室溫存活率與胃酸中通過(guò)率低、不產(chǎn)丁酸、治療效果慢的缺點(diǎn)，能夠廣泛應(yīng)用于諸如急、慢性腸炎引起的腹瀉、非潰瘍性消化不良、腸易激綜合癥以及各種原因（腸道感染、外科手術(shù)等）所致的腸道菌群紊亂等腸道疾病的治療，且療效穩(wěn)定，有效率達(dá)90%以上，尤其是對(duì)使用抗生素后所致的偽膜性腸炎有著獨(dú)特的效果，很快成為該領(lǐng)域的國(guó)際壟斷產(chǎn)品[3,5-6]。從此，丁酸梭菌制劑在日本開(kāi)始作為調(diào)理人體胃腸功能的整腸藥一直使用至今。

1.2 我國(guó)對(duì)丁酸梭菌的引進(jìn)、自主創(chuàng)新與產(chǎn)業(yè)化

我國(guó)的黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，于1992年自俄羅斯微生物研究所引進(jìn)丁酸梭菌，并在中國(guó)定植。我國(guó)自1993年起，自日本進(jìn)口丁酸梭菌制劑，先后在上海、廣州、哈爾濱等十幾家著名醫(yī)院用于治療腸道菌群紊亂引起的腸炎、腹瀉、消化不良等疾患，療效顯著。我國(guó)從1996年開(kāi)始研制能替代抗生素治療頑固性腸炎、腹瀉，預(yù)防腸病并發(fā)癥及腸癌的微生態(tài)生物藥物，并列入國(guó)家863重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目，項(xiàng)目主持人為留學(xué)歸國(guó)人員、著名醫(yī)學(xué)微生態(tài)專(zhuān)家崔云龍博士。崔云龍博士及其領(lǐng)導(dǎo)的團(tuán)隊(duì)，歷經(jīng)2年多的時(shí)間，自偏遠(yuǎn)山嶺、荒野采集的2萬(wàn)份樣品中篩選出50多個(gè)新菌種，幾經(jīng)比較，最后篩選出丁酸梭菌CGMCC313-1菌株。這是我國(guó)第一株治療腹瀉、腸炎、阻止腸惡變的藥用丁酸梭菌菌株。經(jīng)過(guò)中國(guó)藥品生物制品檢定所反復(fù)檢驗(yàn)，論證其綜合性狀遠(yuǎn)超國(guó)際同類(lèi)菌種。隨后，又經(jīng)3年多的研究、歷經(jīng)2萬(wàn)多次試驗(yàn)，逐一攻克了丁酸梭菌的高產(chǎn)量發(fā)酵技術(shù)、低溫分離技術(shù)、制劑技術(shù)以及常溫保存技術(shù)等關(guān)鍵技術(shù)。他們運(yùn)用自主研發(fā)的發(fā)酵工藝，丁酸梭菌的產(chǎn)量每毫升含菌量達(dá)到1億個(gè)、芽孢比例達(dá)到95%，這是目前可查到的國(guó)際專(zhuān)利數(shù)據(jù)的100倍，臨床研究結(jié)果也證實(shí)其療效超過(guò)同類(lèi)的日本產(chǎn)品。2003年10月開(kāi)始該項(xiàng)成果的產(chǎn)業(yè)化，2004年試產(chǎn)成功，并成功實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，拓開(kāi)了市場(chǎng)，從而徹底打破了日本半個(gè)多世紀(jì)以來(lái)對(duì)該技術(shù)的壟斷。目前，丁酸梭菌已普遍應(yīng)用于人的腸道疾病。特別值得指出的是，崔云龍團(tuán)隊(duì)成功發(fā)明的常溫條件下長(zhǎng)期保存丁酸梭菌活性技術(shù)，標(biāo)志著我國(guó)成為當(dāng)今世界上在微生態(tài)生物制劑領(lǐng)域里掌握著該核心技術(shù)的唯一國(guó)家。與此同時(shí)，崔云龍團(tuán)隊(duì)還成功研制出其他能夠治療腸道菌群失調(diào)、恢復(fù)腸道健康，具有一定活性的微生態(tài)制劑。例如，藥用凝結(jié)芽孢桿菌TBC-169菌株。這是一株藥用價(jià)值很高的優(yōu)秀菌株，能選擇性促進(jìn)腸道雙歧桿菌等益生菌的生長(zhǎng)繁殖，并分泌抗菌凝固素，對(duì)7種腸道致病菌的生長(zhǎng)繁殖有較強(qiáng)的頡頏與抑制作用。我國(guó)因此成為世界上第二個(gè)具備該制劑生產(chǎn)技術(shù)的國(guó)家。

1.3 丁酸梭菌作為飼料添加劑在我國(guó)的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用

1.3.1 丁酸梭菌被批準(zhǔn)用作畜禽飼料添加劑

我國(guó)原農(nóng)業(yè)部于2006年將丁酸的鈉鹽- 丁酸鈉（Sodium Butyrate）列入《飼料添加劑品種目錄》。丁酸鈉產(chǎn)品應(yīng)用于動(dòng)物飼料中，主要是發(fā)揮其胃腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)劑、腸黏膜營(yíng)養(yǎng)劑、電解質(zhì)平衡調(diào)節(jié)劑、復(fù)合酸化劑、誘食劑以及香味劑等作用。2009年7月，我國(guó)原農(nóng)業(yè)部正式批準(zhǔn)丁酸梭菌制劑作為新飼料添加劑，可在包括養(yǎng)豬業(yè)在內(nèi)的畜牧生產(chǎn)上使用[7]，這極大地推動(dòng)了丁酸梭菌作為飼料添加劑在我國(guó)的研究與應(yīng)用。

1.3.2 我國(guó)成功研制出可作為飼料添加劑的丁酸梭菌

我國(guó)研究者對(duì)丁酸梭菌的研究主要是在人的醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用上，但作為飼料添加劑的應(yīng)用研究，也就是近幾年的事。

趙建新等于2002年，自健康人的糞中分離到4株丁酸梭菌并對(duì)其進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)其中的丁酸梭狀芽孢桿菌Z-10菌株可用作生產(chǎn)飼用益生菌[8]。浙江惠嘉生物科技有限公司最先研制出可用作飼料添加劑的丁酸梭菌，并于2009 年11月，獲得了原農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的全國(guó)首個(gè)益生菌方面的飼料添加劑新產(chǎn)品證書(shū)，同時(shí)獲得新產(chǎn)品證書(shū)的還有該公司生產(chǎn)的地衣芽孢桿菌。此后，浙江惠嘉在這兩個(gè)產(chǎn)品基礎(chǔ)上，相繼增加了多種芽孢桿菌、乳酸菌和微生物代謝產(chǎn)物，形成了一個(gè)系列的益生菌制劑產(chǎn)品，在全國(guó)乃至世界范圍推廣[9]。2016年3月，江蘇三儀生物產(chǎn)業(yè)集團(tuán)制定的丁酸梭菌及新型復(fù)合酶制劑企業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)通過(guò)驗(yàn)收，這為三儀集團(tuán)申報(bào)以丁酸梭菌為主的單一型與混合型飼料添加劑以及酶制劑的生產(chǎn)資質(zhì)奠定了基礎(chǔ)[10]。

近年來(lái)，我國(guó)的有關(guān)大專(zhuān)院校、科研院所以及企業(yè)加大了丁酸梭菌作為飼料添加劑的研發(fā)，成果已在動(dòng)物養(yǎng)殖領(lǐng)域應(yīng)用。然而，就整體而言，將丁酸梭菌成功地商業(yè)化用作畜禽水產(chǎn)飼料添加劑，目前還多是韓國(guó)、日本等少數(shù)幾個(gè)廠家生產(chǎn)的丁酸梭菌制劑。

2 丁酸梭菌的生物學(xué)特性

2.1 丁酸梭菌是一個(gè)集芽孢桿菌與乳酸菌優(yōu)點(diǎn)于一身的天然綠色菌種

丁酸梭菌既能像芽孢桿菌那樣具有諸如耐熱（常溫下易保存）、耐胃酸、耐膽鹽等抗逆性，又能像乳酸菌那樣在腸道厭氧環(huán)境下生長(zhǎng)、并產(chǎn)生乳酸，特別是還能產(chǎn)生丁酸；既克服了芽孢桿菌在腸道這樣的厭氧環(huán)境下，不能很好地生長(zhǎng)、且不產(chǎn)乳酸的缺點(diǎn)，又克服了乳酸菌耐熱性差，室溫存活率低，在常溫下不易保存、65～75 ℃下即死亡，在生產(chǎn)乳酸菌制劑過(guò)程中死亡率高，不適于在制粒飼料中添加，胃酸通過(guò)率低，且不能產(chǎn)生丁酸的缺點(diǎn)；所以，丁酸梭菌是一個(gè)集芽孢桿菌與乳酸菌優(yōu)點(diǎn)于一身的極具潛力的飼用益生菌。丁酸梭菌無(wú)毒副作用，不存在毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)，既可用作飼用益生菌種，又可用作治療藥物；既像食品一樣安全，又像藥品一樣有效（針對(duì)慢性腹瀉、腸炎等腸道疾?。?；打破了 是藥三分毒 的傳統(tǒng)觀念，是真正安全的天然綠色菌種。丁酸梭菌制劑是剛剛起步且極具潛力的飼用益生菌制劑[11]。

2.2 丁酸梭菌的抗逆性強(qiáng)

丁酸梭菌由于能夠生成芽孢，因而具有耐熱、耐酸、耐鹽、易保存的生理特征。特別丁酸梭菌所生成的芽孢為內(nèi)生芽孢，使得其具有較強(qiáng)的抗逆性，表現(xiàn)在：1）耐熱。丁酸梭菌制劑經(jīng)80 ℃、30 min和90 ℃、10 min熱處理后的存活率為98%；經(jīng)90 ℃、20 min熱處理后的存活率為95%；經(jīng)100 ℃、5 min熱處理后的存活率仍高達(dá)80%。因此，丁酸梭菌足以耐受飼料制粒過(guò)程中的高溫、高熱工藝；2）耐酸。丁酸梭菌在pH為1.0～5.0時(shí)仍能存活，同時(shí)丁酸梭菌對(duì)pH的適應(yīng)范圍較廣，在pH為4.0～9.8時(shí)仍能適合其生長(zhǎng)；3）耐酸、耐鹽、耐膽汁。無(wú)論是動(dòng)物胃腸道環(huán)境還是人工胃液、腸液和膽鹽，丁酸梭菌都具有良好的耐受性，能在其中存活，進(jìn)入動(dòng)物腸道后亦能夠存活生長(zhǎng)；4）耐干燥。丁酸梭菌的固體活菌制劑，在干燥、室溫環(huán)境下保存3年以上，活菌數(shù)未見(jiàn)減少[12]。飼用丁酸梭菌制劑中的活菌是以芽孢形式存在的，因而能夠適應(yīng)腸道的產(chǎn)酸、產(chǎn)膽汁鹽的厭氧環(huán)境，發(fā)揮調(diào)節(jié)菌群平衡的功能，并能夠順利地通過(guò)飼料生產(chǎn)（含制粒）加工，這樣就基本滿足了綠色益生菌制劑產(chǎn)業(yè)化的全部需求。

2.3 丁酸梭菌在動(dòng)物腸道內(nèi)的五大生物學(xué)特性

丁酸梭菌作為飼用益生菌種，在動(dòng)物腸道內(nèi)呈現(xiàn)出五大生物特性：1）丁酸梭菌作為厭氧芽孢桿菌，不受胃酸、膽汁酸等影響；2）丁酸梭菌產(chǎn)生的丁酸、乳酸，能夠促進(jìn)動(dòng)物腸道中乳酸菌、雙歧桿菌等有益菌群的增殖與發(fā)育，抑制腸道內(nèi)有害菌和腐敗菌的生長(zhǎng)、繁殖，糾正腸道菌群紊亂，調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡，減少腸毒素的產(chǎn)生；3）丁酸梭菌在動(dòng)物腸道內(nèi)產(chǎn)生的淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶等消化酶以及B 族維生素、維生素K等維生素，這些物質(zhì)連同丁酸等對(duì)動(dòng)物具有營(yíng)養(yǎng)保健作用[13]；4）丁酸、乙酸、氫氣等丁酸梭菌的代謝產(chǎn)物，能夠減輕腸道炎癥，加速腸道損傷修復(fù)，尤其是主要代謝產(chǎn)物丁酸，它是腸道上皮組織細(xì)胞再生和修復(fù)的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[14-15]；5）對(duì)多種飼用抗生素具有較強(qiáng)的耐受性，可以與之配伍使用。由此可見(jiàn)，丁酸梭菌作為飼用益生菌，集芽孢桿菌與乳酸菌的優(yōu)點(diǎn)于一身，既具有優(yōu)良的生產(chǎn)性能，又具有耐熱、易貯藏、適應(yīng)動(dòng)物腸道微生態(tài)環(huán)境（厭氧、酸、膽鹽）的特性，對(duì)于減少當(dāng)前動(dòng)物生產(chǎn)中飼用抗生素的濫用、減少藥物在肉、蛋、乳等畜禽產(chǎn)品中的殘留、降低動(dòng)物細(xì)菌的耐藥性與保障動(dòng)物健康方面有著重要的意義，是一個(gè)極具潛力的飼用益生菌種，有著廣闊的市場(chǎng)前景。

3 丁酸梭菌的組合應(yīng)用

3.1 丁酸梭菌與益生菌的組合應(yīng)用

不同的益生菌制劑，有著不同的作用機(jī)制與途徑，解決的問(wèn)題也不盡相同。僅憑某個(gè)單一的益生菌制劑，通常很難完全滿足養(yǎng)殖動(dòng)物的生理要求。根據(jù)具體的養(yǎng)殖品種，將相互促進(jìn)發(fā)揮協(xié)同作用，而不是相互頡頏產(chǎn)生抑制作用的幾種益生菌在正組合效應(yīng)基礎(chǔ)上，按照一定比例配伍制成協(xié)同共生、優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)的復(fù)合益生菌制劑，就能發(fā)揮出比單一菌制劑更顯著的應(yīng)用效果，共同完成對(duì)動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)調(diào)控作用。丁酸梭菌作為飼用益生菌，既可單獨(dú)添加，也可與一些益生菌配伍使用，以發(fā)揮益生菌群間互作的正組合效應(yīng)。例如，將丁酸梭菌與地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌進(jìn)行集成，組合成一個(gè)具有多種功能的綠色 三酵菌 制劑，能較好地解決動(dòng)物的腸道健康問(wèn)題，從而在動(dòng)物生產(chǎn)中少用或者不用抗生素。鑒于腸球菌易產(chǎn)生耐藥性、移位及室內(nèi)感染，世界衛(wèi)生組織建議在復(fù)合益生菌制劑中不應(yīng)含有腸球菌，我國(guó)目前雖然還沒(méi)有這方面的明確規(guī)定，在選擇與丁酸梭菌配伍的益生菌時(shí)，還是應(yīng)盡量避免選用腸球菌[7]。目前，在養(yǎng)豬生產(chǎn)中常見(jiàn)的與丁酸梭菌配伍的幾個(gè)菌種組合，如應(yīng)用于斷奶仔豬的丁酸梭菌與戊糖片球菌、植物乳桿菌、酵母菌、枯草芽孢桿菌配伍組成的復(fù)合菌劑。

3.2 丁酸梭菌與其他營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)的配伍使用

丁酸梭菌或其復(fù)合益生菌制劑與：1)益生元、酶制劑、中草藥制劑等的配伍；2)酸化劑、益生素、中草藥提取物等的配伍；3)復(fù)合酶制劑（包括蛋白酶、淀粉酶、β-甘露聚糖酶、木聚糖酶與單寧酶）的配伍；4)酵母細(xì)胞壁和核苷酸的配伍；5)低聚木糖等的配伍。

3.3 丁酸梭菌與抗生素的組合應(yīng)用

1)由于丁酸梭菌對(duì)鏈霉素、紅霉素、強(qiáng)力霉素、氨芐青霉素、潔霉素、羥氨芐青霉素、沙交霉素、磺胺甲硝唑、頭孢立新、阿米卡星、環(huán)丙沙星、多黏菌素E等多種抗生素，尤其是吡哌酸與氨基糖苷類(lèi)抗生素具有抗性，對(duì)這些抗生素不敏感，故丁酸梭菌作為獸藥在與這些抗生素聯(lián)合使用時(shí)，其生物功能不僅不受影響，還能加強(qiáng)抗生素的治療效果，減少抗生素的用量，避免長(zhǎng)期大量應(yīng)用抗生素給動(dòng)物及人類(lèi)的健康帶來(lái)危害；2)丁酸梭菌的這種對(duì)多種抗生素的抗性，對(duì)其在目前普遍添加有抗生素的飼料中，而養(yǎng)殖場(chǎng)又濫用抗生素的情況下，仍能發(fā)揮其功效有著特殊意義；3)丁酸梭菌并不是對(duì)所有抗生素都有抗性或不敏感，丁酸梭菌與抗生素組合應(yīng)用時(shí)，不能與氯霉素、先鋒霉素、新生霉素、萬(wàn)古霉素、林可霉素、替硝唑、甲硝唑、氨芐西林、四環(huán)素等組合使用，因?yàn)槎∷崴缶鷮?duì)這些抗生素不具抗性[11]。

4 導(dǎo)致飼用丁酸梭菌等益生菌制劑效果不穩(wěn)定的因素

上面闡述的丁酸梭菌的諸多優(yōu)點(diǎn)，是在嚴(yán)格控制試驗(yàn)條件下所得到的研究結(jié)果，與商業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)的條件相比，還存著較大差距。這就是動(dòng)物飼料中添加飼用丁酸梭菌等益生菌制劑，有時(shí)效果不明顯，甚至完全沒(méi)有效果的原因，這不完全是丁酸梭菌等益生菌制劑自身的問(wèn)題，下列情況下即使使用品質(zhì)好的益生菌制劑，也不一定能表現(xiàn)出好的效果：1)丁酸梭菌等益生菌制劑在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用，重在維持腸道健康、防病與促生長(zhǎng)，不在治病，療效不如抗生素那樣迅速很正常；2)一些飼料其營(yíng)養(yǎng)水平配制已較高，添加丁酸梭菌等益生菌制劑的效果就不一定顯著。而在營(yíng)養(yǎng)水平較低的日糧中添加丁酸梭菌等益生菌制劑，其效果就比在營(yíng)養(yǎng)水平較高的日糧中添加顯著。較高的營(yíng)養(yǎng)水平配制，典型的例子有：①日糧已添加酸化劑、植物提取物、植物精油、寡糖等任何一種添加劑的飼料或其組合物；②已添加功能脂肪（ω-3多不飽和脂肪，具抗氧化、抗應(yīng)激功能）、動(dòng)能脂肪（中鏈脂肪特別是OPO（1，3-二油酸2-棕櫚酸甘油三酯）脂肪，能夠?yàn)椴溉樽胸i快速補(bǔ)充能量，快速恢復(fù)體能）的哺乳仔豬日糧；③添加有優(yōu)質(zhì)桑葉粉（粗蛋白高于28%）的斷奶仔豬日糧，因?yàn)樯Ｈ~亦具有抑制腸道金黃色葡萄菌、大腸桿菌等致病菌，促進(jìn)腸道乳酸菌、雙岐桿菌等益菌生長(zhǎng)的功能，從而通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群數(shù)量維持動(dòng)物腸道菌群平衡的功能；3)菌株宿主源性造成的差異，即來(lái)源于豬腸道分離的菌株，其對(duì)豬的效果明顯而對(duì)雞則未必有效，所以不同來(lái)源的丁酸梭菌菌株及其復(fù)合菌制劑以及其他益生菌制劑，應(yīng)根據(jù)其菌株來(lái)源而選擇最適合的使用對(duì)象；4）動(dòng)物在不同生長(zhǎng)期，其對(duì)益生菌的需求不同。初生動(dòng)物由于腸道菌群尚未建立或處于不穩(wěn)定狀態(tài)，此時(shí)飼喂丁酸梭菌等益生菌要比后期腸道已建立起相對(duì)穩(wěn)定的菌群后使用益生菌的效果明顯；5）就哺乳動(dòng)物而言，因斷奶前后日糧的差異，造成腸道中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的差異，結(jié)果導(dǎo)致所需的益生菌群差異，這就要求差異性地供給動(dòng)物適用的益生菌（含與丁酸梭菌配伍的不同專(zhuān)用菌）；6）環(huán)境條件較差時(shí)，給生產(chǎn)動(dòng)物飼喂丁酸梭菌等益生菌的效果要顯著得多，這是因?yàn)樗曃箘?dòng)物的腸道內(nèi)的菌群組成缺乏有益菌或腸道內(nèi)存在著反作用菌（即抑制生長(zhǎng)的菌）時(shí)，飼喂丁酸梭菌等益生菌的效果更明顯；而當(dāng)動(dòng)物自然接種了大量有益菌或其腸道內(nèi)不存在反作用菌時(shí)，飼喂丁酸梭菌等益生菌的效果則不明顯；7）盡管丁酸梭菌對(duì)大部分抗生素具有抗性，但并不是對(duì)所有的抗生素均有抗性，特別是：一方面，配合飼料中添加的亞治療量抗生素，遠(yuǎn)超丁酸梭菌的耐受性劑量；另一方面，與丁酸梭菌配伍的其他益生菌對(duì)抗生素敏感，因此在添加飼用丁酸梭菌等益生菌制劑時(shí)，還是要注意飼料中所添加的抗生素的品種及其含量；8）由于丁酸梭菌等益生菌菌株間存在著血清型的周期性變異，滯留在腸道中的菌株能否繼續(xù)存在，還取決于其競(jìng)爭(zhēng)性爭(zhēng)奪腸黏膜結(jié)合位點(diǎn)的能力。因此，丁酸梭菌等益生菌應(yīng)持續(xù)在飼料中添加使用。

5 存在問(wèn)題與展望

當(dāng)前，開(kāi)發(fā)利用丁酸梭菌所存在的問(wèn)題及其改進(jìn)方法：1）丁酸梭菌是極其嚴(yán)格的厭氧菌，發(fā)酵生產(chǎn)的得菌率低，限制了它的廣泛應(yīng)用。特別是由于不同生產(chǎn)廠家的菌株來(lái)源及發(fā)酵水平的差異，導(dǎo)致市場(chǎng)產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，使用效果貶褒不一。今后除須進(jìn)一步加強(qiáng)丁酸梭菌生產(chǎn)工藝的研究外，還要優(yōu)化出更適合丁酸梭菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基；2）目前，對(duì)于丁酸梭菌及其代謝產(chǎn)物在動(dòng)物體內(nèi)的代謝過(guò)程、作用機(jī)制尚未徹底明了，只有全面、深入地掌握了其具體的作用機(jī)理，才能更好地發(fā)揮丁酸梭菌的作用；3）丁酸梭菌與其他益生菌配伍的組合效應(yīng)及其機(jī)理有待進(jìn)一步深入研究；4）丁酸梭菌在不同動(dòng)物及同一種動(dòng)物不同階段、生理狀態(tài)的適宜添加量研究；5）利用基因工程技術(shù)，對(duì)現(xiàn)有丁酸梭菌進(jìn)行改造，以期獲得更加優(yōu)良的菌種。例如，鑒于丁酸梭菌是一種適合于木質(zhì)纖維素同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)丁酸的菌種，可以利用阿拉伯糖、葡萄糖、纖維二糖、木糖等多種底物進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酸（主要發(fā)酵產(chǎn)物為丁酸和乙酸）。將丁酸梭菌乙酸發(fā)酵關(guān)鍵基因取代為丁酸發(fā)酵關(guān)鍵基因來(lái)構(gòu)建突變株，可增加突變株的丁酸發(fā)酵產(chǎn)量，減少乙酸的發(fā)酵量。Niall等[16]分別將來(lái)源于丙酮丁醇梭菌的丁酸代謝關(guān)鍵酶基因- 乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因(thl)、來(lái)源于丁酸梭菌本身的乙酸代謝關(guān)鍵酶基因片段- 磷酸轉(zhuǎn)乙?；富蚱?pta)和來(lái)源于質(zhì)粒pIMP1的紅霉素抗性基因(em)。將它們與質(zhì)粒pUC19相連構(gòu)建為非復(fù)制性質(zhì)粒pUC19-EPT。通過(guò)電轉(zhuǎn)化將其導(dǎo)入丁酸梭菌中。再利用紅霉素抗性平板篩選獲得轉(zhuǎn)化子，通過(guò)PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)：獲得的突變株染色體上pta被thl替換。在以葡萄糖為底物的發(fā)酵中，突變株丁酸得率為0.47，較野生型增長(zhǎng)了34%，乙酸得率為0.05，較野生型下降了29%。這為新型丁酸梭菌基因工程菌的構(gòu)建提供了借鑒。