杜超 ，劉深賀 ，程春寶，周子超 ，阮健 ，南良康 ，張淑君

（1.農(nóng)業(yè)動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，武漢 430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，武漢 430070；3.湖北省畜禽育種中心，武漢 430070）

奶牛配種后，及時且準確的妊娠診斷對于牧場高效的繁殖管理十分重要。未妊娠奶牛若不能及時診斷出來，會延長空懷期，導致產(chǎn)犢間隔延長，繁殖效率降低，產(chǎn)奶量降低，進而造成經(jīng)濟損失等[1,2]。因此，配種后在盡可能短的時間內(nèi)進行準確的妊娠診斷，在奶牛生產(chǎn)實踐中具有重要意義。目前常用的奶牛妊娠診斷方法主要有直腸檢測法、超聲波檢測法和妊娠相關物質檢測法等。近年來，隨著高通量技術的發(fā)展，轉錄組學、蛋白組學、代謝組學及中紅外光譜（mid-infrared spectroscopy, MIRS）等新型技術也已應用于奶牛的妊娠診斷，且已經(jīng)初步取得了一定的成果。

1 直腸檢測法和超聲波檢測法

傳統(tǒng)的奶牛妊娠診斷方法主要是直腸檢查法和超聲波診斷法等。通常情況下，這兩種檢測法相結合，稱為經(jīng)直腸超聲波檢測法。此外，也有經(jīng)皮膚的超聲波檢測法。Hunnam等分別利用經(jīng)直腸和經(jīng)皮膚超聲波技術對1 570頭奶牛進行妊娠診斷，結果表明，在人工授精后31～155d，經(jīng)直腸的準確率高于經(jīng)皮膚法，在156～196d，二者的準確率無顯著差異，幾乎均可達到100%。由于經(jīng)皮膚法簡便，易于操作，因此，經(jīng)直腸法適用于早中期妊娠診斷，而經(jīng)皮膚法適用于中晚期妊娠診斷[3,4]。Gaja等利用超聲波技術監(jiān)測人工授精后牛黃體變化情況，結果發(fā)現(xiàn)，未妊娠牛在14～23d黃體逐漸退化；而妊娠牛在14～23d黃體維持在一定大小，不發(fā)生退化，且在18～23d妊娠牛黃體退化率顯著低于未妊娠牛[5]。Gomez-Seco等表明，從人工授精后第19天開始，未妊娠牛的黃體開始退化，而妊娠牛的黃體體積保持在一定大小，且在20～22d，妊娠牛黃體體積顯著大于未妊娠牛[6]。Scully等利用超聲波技術研究表明，在人工授精后7～18d，妊娠牛與未妊娠牛的黃體回聲特征及子宮回聲特征無明顯差異，黃體的面積及黃體的血流面積也無明顯差異，然而，在16～18d妊娠牛的黃體血流量比（黃體血流面積與黃體面積的比值）顯著高于未妊娠牛[7]。

由此可見，利用經(jīng)直腸超聲波技術，通過監(jiān)測黃體的退化情況、面積大小或者其他特征，可對奶牛進行妊娠診斷。但這兩種診斷法操作過程繁瑣，易對牛產(chǎn)生侵入性傷害，同時對操作人員的技術要求比較高，若操作不當，容易造成胚胎死亡[8]。

2 妊娠相關物質診斷法

妊娠期間，由于生殖器官分泌水平的改變或者早期孕體的特異性表達，會導致母體血液、乳汁中的部分妊娠相關物質，如孕酮、妊娠相關糖蛋白（pregnancy associated glycoproteins, PAGs）等的含量發(fā)生改變，這種改變可被用作妊娠診斷。

2.1 孕酮

孕酮主要是由卵巢上的黃體分泌。奶牛配種后，未妊娠牛由于黃體的退化，孕酮含量較低，而妊娠牛因黃體持續(xù)存在，孕酮含量可維持在較高水平。Gaja等研究表明，未妊娠牛在人工授精后第16天開始，血液中孕酮含量急劇下降，妊娠牛則可維持在一定水平，在18～23d，妊娠牛顯著高于非妊娠牛[5]。Scully等得出同樣的研究結果[7]。Gomez-Seco等研究表明，從人工授精后第18天開始，未妊娠牛血液中孕酮含量持續(xù)下降，妊娠牛則維持在一定水平，18～22d妊娠牛顯著高于未妊娠牛[6]。此外，Xu等研究表明，妊娠牛乳汁中孕酮含量均大于7ng/mL，而非妊娠牛則低于3ng/mL[9]。

2.2 妊娠相關糖蛋白（PAGs）

妊娠相關糖蛋白（PAGs）是哺乳動物妊娠期間，由胎盤滋養(yǎng)層細胞合成并分泌的一類糖蛋白，其中，妊娠特異性蛋白B（PSPB）是最早被鑒定的妊娠相關糖蛋白家族成員。Friedrich等研究表明，奶牛配種后，未妊娠牛血液中PAGs含量維持在較低水平，妊娠牛在約22d開始其含量逐漸升高，25～35d，妊娠牛含量顯著高于未妊娠牛[10]。Gajewski等研究表明，奶樣中PAGs含量的變化趨勢與血樣中一致，即未妊娠牛一直維持在較低水平，而妊娠牛從配種后第28天開始逐漸升高[11]。

通過檢測妊娠相關物質的含量進行妊娠診斷，具有簡單、快速等優(yōu)點。然而，這種方法一般在配種后四周左右才能獲得可靠結果，其靈敏度、特異性、陽性預測值以及陰性預測值等指標一般均可達到90%以上[11,12～20]。而在配種后的第一個情期內(nèi)（21d），利用上述四個指標無法獲得可靠的結果。因為奶牛的發(fā)情周期是21d，這就會導致授精后未妊娠奶牛錯過配種時期，從而增加生產(chǎn)成本。此外，妊娠相關物質的檢測方法主要是放射免疫法（RIA）和酶聯(lián)免疫法（ELISA）等。然而，這兩種方法對檢測儀器設備要求比較高，費用昂貴，尤其是RIA法，需要使用專門的放射性同位素，若操作不當，會造成放射性同位素的浪費甚至會有輻射的危害[9]。

3 新型技術在奶牛妊娠診斷中的應用

近年來，隨著高通量技術的逐漸成熟，一些新型技術，如轉錄組學技術、蛋白組學技術、代謝組學技術以及中紅外光譜技術（mid-infrared spectroscopy,MIRS）等已應用于奶牛的妊娠診斷。這些新型技術已取得了一定的成果，組學技術已初步鑒定到一些妊娠相關生物標志物，如基因、miRNA、氨基酸以及蛋白質等，MIRS技術已初步鑒定出若干妊娠奶樣與未妊娠奶樣的差異光譜區(qū)域或應用于奶牛妊娠診斷判別模型的建立等。

3.1 組學技術鑒定的妊娠相關生物標志物

3.1.1 基因

Mayer等研究表明，人工授精后第20天，妊娠奶牛血液中art2a和bovb基因的表達量顯著高于未妊娠奶牛，尤其是bovb基因靈敏度以及特異性達到83%和75%[21]。Sakumoto等采集人工授精后14～18d的奶牛血樣，通過qRT-PCR研究表明，妊娠CCL8和CXCL10基因的表達量呈現(xiàn)上升趨勢，且在第18天時顯著升高，而非妊娠牛的表達量無變化。由此可見，通過檢測這些基因的表達量變化有助于早期妊娠診斷[22]。Yoshino等研究表明，人工授精后20～22d，妊娠奶牛血樣中ISG15和MX2基因的表達顯著高于未妊娠奶牛，診斷準確率可達到80%[23]。

3.1.2 miRNAs

Ioannidis等采集發(fā)情后第0、8和16天未妊娠奶牛的血樣以及配種后第24天妊娠奶牛的血樣，通過miRNA測序以及qPCR驗證的方法，發(fā)現(xiàn)16個差異表達的miRNA，此外，妊娠牛miR-26a的表達顯著高于未妊娠牛，因此miR-26a可以作為早期妊娠診斷的潛在的生物標志物[24]。隨后，為了擴大妊娠診斷的范圍，Ioannidis等對發(fā)情當天和配種后第60天妊娠奶牛的血樣進行miRNA測序，結果共發(fā)現(xiàn)77個差異表達的miRNA，且miRNA-26a在發(fā)情當天、配種后第8、16和60天妊娠牛血樣中的表達量呈現(xiàn)上升趨勢，且在配種后第8天妊娠牛血樣中的表達量就顯著高于發(fā)情當天，進一步表明miRNA-26a在奶牛早期妊娠階段可能發(fā)揮著重要的作用[25]。Schanzenbach等采集發(fā)情后第4、12、18天奶樣以及配種后第4、12、18天妊娠牛的奶樣，通過miRNA測序方法共發(fā)現(xiàn)25個差異表達的miRNA[26]。Markkandan等在未妊娠牛和配種后第30天妊娠牛的血樣中共檢測出29個差異表達的miRNA[27]。

3.1.3 氨基酸和蛋白質

Han等采集未妊娠牛的奶樣和人工授精后第35天妊娠牛的奶樣，利用蛋白質組學分析技術，發(fā)現(xiàn)39個差異表達蛋白。進一步通過蛋白質免疫印跡驗證實驗將lactoferrin以及alpha-1G確定為早期妊娠診斷的生物標志物[2]。GUO等以10頭奶牛為研究對象，經(jīng)同期發(fā)情處理后，采集發(fā)情當天和人工授精后第17天乳樣（10頭奶牛后期均被確定為成功妊娠），采用高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜（LC-Q/TOF-MS）代謝組學技術，篩選兩組乳樣的代謝差異物，最終將L-酪氨酸、N-乙?；?L-酪氨酸、L-脯氨酸、四氫1-苯甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉、鳥苷和十七烷基肉堿確定為妊娠識別階段的潛在乳樣生物標志物[28]。Johnston等利用LC-MS/MS技術對奶牛發(fā)情當天與人工授精后第21天乳樣進行研究，結果發(fā)現(xiàn)APOB、SPADH1、PLIN2和LPO在乳清中差異表達，PIGR、PGD、QSOX1、MUC1、SRPRA、MD2、GAPDH、FOLR1、GPRC5B和HHIPL2，在富含細胞外囊泡的乳清中差異表達，這些蛋白質可能成為潛在的妊娠診斷生物標志物[29]。

3.2 中紅外光譜技術在奶牛妊娠診斷中的應用

中紅外光譜（mid-infrared spectroscopy, MIRS）技術是基于特定區(qū)域中特定波長的各種化學基團的振動，用于定性或者定量檢測物質的一種技術[30]。作為一種新型現(xiàn)代分析檢測技術，MIRS技術具有無損、快速、高通量和低成本等優(yōu)點，已被廣泛應用于牛奶的大規(guī)模檢測[31]。目前，MIRS技術主要是預測牛奶中營養(yǎng)成分的含量，如脂肪酸、礦物元素或者蛋白質等的含量[31]，以及判斷牛奶是否摻假或者是否有抗生素殘留[32～34]等，在奶牛妊娠診斷中的研究尚不多。Lainé等研究表明，妊娠對中紅外光譜968～1 577cm-1區(qū)域的影響最大[35]。Toledo-Alvarado等研究表明，利用脂肪、蛋白質、酪蛋白、乳糖、胎次以及泌乳天數(shù)等作為預測因子，采用一般線性模型預測奶牛是否妊娠時，將MIRS數(shù)據(jù)也作為預測因子加入到預測模型中，會提高預測模型的準確率[36]。這些研究為今后MIRS技術在奶牛妊娠診斷中的應用奠定了一定的基礎。

4 展望

及時準確的妊娠診斷對提高奶牛場的管理效率和養(yǎng)殖經(jīng)濟效益具有重要的意義。目前，雖然已建立了多種奶牛妊娠診斷方法，如直腸檢測法、超聲波診斷法以及妊娠相關物質診斷法等，然而隨著奶牛養(yǎng)殖規(guī)?；图s化程度的不斷提高，這些妊娠診斷方法越來越難以滿足現(xiàn)代奶牛養(yǎng)殖需求。因此，開發(fā)簡便、快速的奶牛妊娠診斷技術十分必要。今后，可利用組學等新型技術繼續(xù)篩選妊娠相關生物標志物，通過生物信息學分析，尋找與妊娠相關的關鍵基因或者蛋白，并結合功能驗證實驗闡明關鍵基因或者蛋白的作用機制，進而應用于奶牛的妊娠診斷。此外，也可在現(xiàn)有 MIRS技術在奶牛妊娠診斷研究的基礎上，嘗試利用MIRS數(shù)據(jù)建立妊娠診斷判別模型，進而快速（甚至是在配后的第一個情期內(nèi)）準確地判斷奶牛的妊娠狀況，進一步提高奶牛的繁殖管理效率。