李偉 吳文禮 李丹 母繼進 曹磊

檢驗科在引進新的實驗方法、試劑或儀器時，都要對其技術(shù)或產(chǎn)品性能指標(biāo)（如精密度、準(zhǔn)確度、線性范圍等）作出評價［1］。本實驗室近期引進一臺深圳邁瑞公司生產(chǎn)的BS-460型全自動生化分析儀，同時使用其配套葡萄糖測定試劑盒，為驗證該試劑盒說明書聲明的線性范圍，本室參考美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）EP6-A2方法對BS-460型全自動生化分析儀測定葡萄糖的線性范圍進行驗證實驗，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 儀器與試劑 儀器采用TDZ4-WS臺式低速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司），移液器（上海求精生化試劑儀器有限公司，規(guī)格：200～1 000 μL），BS-460型全自動生化分析儀（深圳邁瑞公司）；試劑采用葡萄糖（glucose，Glu）測定試劑盒（葡萄糖氧化酶法）及其配套校準(zhǔn)品（邁瑞公司，批號：141518001）；質(zhì)控品（邁瑞公司），常規(guī)生化復(fù)合定值質(zhì)控品（正常水平）（邁瑞公司，批號：050217006）。

1.1.2 樣本來源 從本院患者樣本中選擇一高血糖樣本（血糖濃度為24.56 mmol/L）的血清；生理鹽水為市售醫(yī)用品。

1.1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用IBM SPSS Statistics 22.0統(tǒng)計分析軟件包分析處理實驗數(shù)據(jù)。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣本配制 選取血糖濃度為24.56 mmol/L的患者血清作為高值樣本（H），低值樣本（L）以生理鹽水代替。按照1L、0.2H +0.8L、0.4H+0.6L、0.6H+0.4L、0.8H+0.2L、1H將H和L配制為6個系列濃度的實驗樣本。

1.2.2 檢測步驟 對上述6個實驗樣本隨患者樣本在邁瑞B(yǎng)S-460型全自動生化分析儀上進行測定，每個實驗標(biāo)本重復(fù)測定2次，2次檢測的間隔時間盡量縮短。

1.2.3 實驗結(jié)果 記錄結(jié)果，每個樣本2次檢測的結(jié)果計算均值。觀察所收集數(shù)據(jù)有無明顯的離群點，如有應(yīng)查找原因。若有明確原因，糾正后修正數(shù)據(jù)；若無明確原因，則應(yīng)重新檢測全部數(shù)據(jù)。

1.2.4 精密度檢驗

1.2.4.1 計算恒定誤差（SDr） 根據(jù)公式計算SDr。

式中，ri1、為第i個樣本第1次測量的濃度值與其均值的百分比，ri2為第i個樣本第2次測量的濃度值與其均值的百分比。本研究設(shè)定不精密度目標(biāo)為CLIA'88允許誤差的1/4，比較SDr與設(shè)定的不精密度目標(biāo)。如果SDr大于1/4 CLIA'88允許誤差，則有可能是檢測實驗樣本的生化分析檢測系統(tǒng)的精密度太低，其所得的實驗數(shù)據(jù)不能夠可靠且真實地評價線性關(guān)系。此時應(yīng)檢查驗證實驗中人員的具體操作步驟和生化分析儀的技術(shù)問題，查找導(dǎo)致精密度太低的原因，原因得到糾正后，驗證實驗應(yīng)該重新進行。反之，則表示符合。

1.2.4.2 多項式線性評價 以理論值為橫坐標(biāo)，以實測值均值為縱坐標(biāo)進行線性回歸分析，計算一階、二階、三階回歸方程及其回歸標(biāo)準(zhǔn)誤差（Sy.x）。一階、二階、三階回歸方程分別為y＝b0+b1x、y＝b0+b1x+b2x2、y＝b0+b1x+b2x2+b3x3。計算二階（b2）、三階（b2、b3）回歸系數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤（SEi），然后進行 t檢驗。若非線性系數(shù)b2、b3與0比較，經(jīng)t檢驗無顯著差異（P＞0.05），存在線性關(guān)系，不精密度滿足條件時，則分析完成；若二階回歸方程的非線性系數(shù)b2，或三次多項式模型的b2或b3中任一個與0比較，有顯著差異（P＜0.05），則該組數(shù)據(jù)存在非線性。當(dāng)非線性存在時，通過計算多項式的Sy.x，Sy.x值最小的多項式為最適多項式模型。當(dāng)二次多項式或三次多項式為數(shù)據(jù)線性模型時，則需計算每個實驗樣本在最適多項式上的線性偏差，每個線性偏差與設(shè)定目標(biāo)比較，從而評價每個點的非線性程度［2］。

1.2.4.3 非線性度的判斷 當(dāng)最適多項式為二次多項式或三次多項式時，需要計算每個樣本的線性偏離（DLi），公式為 DLi＝p（xi）－（b0+b1xi），式中 x 的取值范圍為x1…x6，p（xi）為最適多項式在點xi處的計算值，b0+b1xi為一次回歸多項式在點xi處的計算值，DLi是最適非線性模型與線性模型在點xi處的差異。

2 結(jié)果

2.1 血糖濃度測定結(jié)果 6個系列濃度樣本進行血糖測定的結(jié)果，見表1。

表1 6組樣本血糖濃度測定結(jié)果

2.2 初步檢查數(shù)據(jù) 初步目測線性檢查未發(fā)現(xiàn)明顯的非線性，目視判斷本實驗的12個檢測數(shù)據(jù)，未發(fā)現(xiàn)離群點。

2.3 計算SDr 根據(jù)SDr計算公式代入實驗數(shù)據(jù)得SDr為0.004 4，小于本研究設(shè)定的不精密度目標(biāo)，表明本實驗測量數(shù)據(jù)的精密度符合線性判斷的要求。

2.4 多項式回歸分析 血糖線性驗證實驗的多項式回歸分析結(jié)果，見表2。

表2 血糖線性驗證實驗的多項式回歸分析結(jié)果

2.5 計算DLi血糖線性驗證實驗的線性偏離計算結(jié)果，見表3。

表3 血糖線性驗證實驗的線性偏離計算結(jié)果

2.6 線性范圍確認(rèn) 以血糖實際濃度為x軸、每個標(biāo)本2次測定濃度的平均值為y軸繪制血糖線性范圍驗證實驗示意圖，見圖1。

圖1 血糖線性范圍驗證實驗

3 討論

線性范圍指試劑盒按說明書使用可準(zhǔn)確測量的范圍，在試劑盒的評價中有重要的作用。試劑盒測定線性范圍是衡量其質(zhì)量的重要指標(biāo)，也是保證正確使用和鑒定試劑盒的關(guān)鍵指標(biāo)之一［3］。本實驗室所用邁瑞葡萄糖測定試劑盒聲明的線性范圍為0.5～25.0 mmol/L，EP6-A2文件要求用戶在自己的實驗室驗證生產(chǎn)廠家說明書告知的線性范圍時，實驗樣本需要5～7個，其濃度范圍要能夠覆蓋試劑盒說明書標(biāo)明的線性范圍，因此本驗證實驗選擇生理鹽水（其血糖濃度為0 mmol/L）作為測定濃度的下限，選擇血糖測定結(jié)果為24.56 mmol/L的患者血清作為測試濃度的上限。用患者血清和生理鹽水按比例精確配制成等間距的6個實驗樣本，且每個樣本重復(fù)測量 2 次［4］。

EP6-A2文件處理實驗數(shù)據(jù)的基本步驟如下：① 首先按順序記錄實驗樣本所得數(shù)據(jù)，目視檢查每一個測定數(shù)據(jù)是否有與其他數(shù)據(jù)比較相差較大的離群值，或者實驗數(shù)據(jù)的測定有明顯的錯誤值。如果是檢測過程中的操作錯誤或化學(xué)分析儀的技術(shù)性問題被發(fā)現(xiàn)，并且得到正確解決，則整個實驗驗證過程應(yīng)該重新進行一遍；如果檢測過程中的操作無誤或化學(xué)分析儀的技術(shù)性問題沒有明顯錯誤，此時應(yīng)審視6個實驗樣本2次重復(fù)檢測所得數(shù)據(jù)是否有離群值，若發(fā)現(xiàn)存在離群值，則應(yīng)該剔除該值。如果2個或2個以上的離群值被發(fā)現(xiàn)，且上述實驗數(shù)據(jù)不能夠被合理解釋，此時應(yīng)懷疑化學(xué)分析儀系統(tǒng)的檢測性能。查找出現(xiàn)問題的原因，如有必要，需請所產(chǎn)化學(xué)分析儀的廠家協(xié)助幫忙。② 對實驗數(shù)據(jù)作精密度檢驗，即計算實驗數(shù)據(jù)的比例誤差（CVr）或SDr，這是因為線性評估還應(yīng)考慮隨機誤差的影響，隨機誤差來源于隨機變異，可能會導(dǎo)致非線性的評估能力降低。將CVr或SDr與不精密度的設(shè)定目標(biāo)進行比較，若CVr或SDr大于實驗室既定的不精密度目標(biāo)，則很有可能為重復(fù)性即精密度太差，這樣的實驗數(shù)據(jù)不能夠用來可靠且真實地評價線性關(guān)系。此時應(yīng)檢查驗證過程中的人員操作問題或是化學(xué)分析儀的問題，查找到精密度低的產(chǎn)生原因，糾正這些原因后，重新進行驗證實驗。只有當(dāng)CVr或SDr小于實驗室設(shè)定的不精密度目標(biāo)時，實驗樣本檢測所得的數(shù)據(jù)才可以進行多項式回歸分析，即一次、二次和三次回歸分析。一次、二次和三次多項式回歸分析后，可以得到線性系數(shù)和非線性系數(shù)，二次和三次多項式的非線性系數(shù)與0進行統(tǒng)計學(xué)比較，其方法采用t檢驗。若二次多項式模型的非線性系數(shù)b2，或三次多項式模型的b2或b3中任意一個與0比較無顯著差異（P＞0.05），則提示該組數(shù)據(jù)呈線性；若非線性系數(shù)b2和b3與0比較有顯著差異（P＜0.05），則提示該組數(shù)據(jù)存在非線性。通過計算多項回歸式的Sy.x，Sy.x最小的多項式即為最適多項式回歸模型，計算Sy.x公式可以參考CLSI 2018年6月頒布的第3版EP09c文件。最適多項式模型確定后，還要計算最適多項式在每組實驗樣本的非線性度，如果最大的線性偏差仍小于設(shè)定目標(biāo)，說明最適多項式的非線性程度可以接受，此時仍可以認(rèn)為在所驗證的實驗樣本濃度范圍內(nèi)該項目呈線性［5-8］。

經(jīng)目視檢查和統(tǒng)計計算，本次線性驗證實驗的樣本數(shù)據(jù)，不存在明顯的離群值和非線性。通過SPSS統(tǒng)計軟件計算，實驗樣本檢測所得數(shù)據(jù)計算的SDr值約為0.4%，SDr小于本實驗室設(shè)定的批內(nèi)不精密度要求，即1/4 CLIA'88允許總誤差（2.5%），表明生化分析檢測系統(tǒng)的隨機誤差對驗證實驗的結(jié)果無明顯影響，實驗樣本的測定數(shù)據(jù)可用于線性評價。通過對實驗數(shù)據(jù)進行多項式回歸分析及計算多項式的Sy.x，統(tǒng)計得出最適多項式模型為二次多項式回歸方程。再通過最適多項式和一次多項式計算得出6個實驗樣本的DLi，6個DLi中的最大值為1.73%，DLi最大值小于設(shè)定的預(yù)期目標(biāo)2.5%，因而可以接受最適多項式的非線性程度。繪制散點圖，其x軸數(shù)值為配制的6組血糖濃度，y軸數(shù)值為6組實驗樣本2次重復(fù)測定的均值，通過散點圖發(fā)現(xiàn)該邁瑞葡萄糖試劑盒在0.5～25.0 mmol/L范圍內(nèi)呈線性，因此本次線性驗證實驗的實驗結(jié)果與試劑盒說明書聲明的線性范圍一致。