金學(xué)琴，黎偉華，李志梅，何生存，潘 琳

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，寧夏 銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，寧夏 銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004；4.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院檢驗(yàn)科，寧夏 銀川 750004）

苦參素（oxymatrine，OMT）又名氧化苦參堿，是一種喹嗪類生物堿，從傳統(tǒng)中藥廣豆根中提取所得[1]，其藥理作用包括調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、抗炎癥、抗過(guò)敏反應(yīng)和抑制組胺釋放[2]。OMT（C15H24N2O2）作為有效的單體生物堿臨床已用于治療慢性病毒性肝炎[3-4]，它能夠顯著降低體內(nèi)血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）的水平，對(duì)臨床癥狀有所改善。有文獻(xiàn)報(bào)道其通過(guò)激活Nrf2/HO-1和調(diào)節(jié)炎性TLR4信號(hào)通路對(duì)肝衰竭起到保護(hù)作用[5]，但其具體作用機(jī)制尚未明確。該試驗(yàn)通過(guò)探討 OMT 對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）通路的影響，進(jìn)一步了解OMT抗肝纖維化的作用機(jī)制，為臨床治療肝纖維化用藥提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：60只雄性SD大鼠（SPF級(jí)），體重 （250±50）g，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK（寧）2015-0001]提供，并飼養(yǎng)于寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障內(nèi)[SCXK （寧）2015-0001]，室溫、晝夜（12 h/12 h）明暗交替飼養(yǎng)，自由進(jìn)水?dāng)z食。 每只動(dòng)物僅用于一個(gè)單一的試驗(yàn)并按動(dòng)物實(shí)驗(yàn)“3R”原則給予人道關(guān)懷。

1.1.2 主要試劑與設(shè)備：氧化苦參堿（OMT）由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，在使用前用生理鹽水配制成所需濃度；水飛薊素膠囊由德國(guó)馬博士大藥廠提供；硫代乙酰胺 （TAA）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷胱甘肽（GSH）各試劑盒由中國(guó)南京建成試劑公司提供；TGF-β1檢測(cè)試劑盒由中國(guó)上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組與處理：將60只SD大鼠隨機(jī)平均分為6組，分別為陰性對(duì)照組、模型組和OMT高、中、低劑量給藥組以及水飛薊素陽(yáng)性對(duì)照組。使用硫代乙酰胺（200 mg/kg）對(duì)OMT高、中、低劑量給藥組和模型組、水飛薊素陽(yáng)性對(duì)照組大鼠進(jìn)行腹腔注射，每周3次，連續(xù)2周；第3周開(kāi)始每周2次，連續(xù)6周；第9周開(kāi)始每周1次，連續(xù)4周。在造模的第2周開(kāi)始至造模結(jié)束，對(duì)陰性對(duì)照組及模型組大鼠給予生理鹽水灌胃；對(duì)OMT高、中、低劑量給藥組大鼠分別給予苦參素（80、40、20 mg/kg）灌胃；對(duì)水飛薊素陽(yáng)性對(duì)照組大鼠給予水飛薊素（30 mg/kg）灌胃，每天1次。至第12周末，處死大鼠并采血留取血清，迅速取其肝組織超低溫保存。

1.2.2 血清中ALT、AST和GSH指標(biāo)的測(cè)定：將大鼠麻醉后取血，將取得血液室溫靜置1 h，3 000 r/min離心15 min，分離上層血清。按試劑盒操作說(shuō)明書(shū)采用酶標(biāo)法檢測(cè)血清中ALT、AST和GSH的含量。

1.2.3 肝組織勻漿中TGF-β1含量的測(cè)定：按試劑盒操作說(shuō)明書(shū)采用酶標(biāo)法測(cè)定肝組織勻漿中TGF-β1含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)，計(jì)量數(shù)據(jù)以±S表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 OMT對(duì)硫代乙酰胺誘導(dǎo)的肝纖維化模型大鼠血清中ALT、AST和GSH的影響

與陰性對(duì)照組相比，模型組大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶ALT和AST含量極顯著升高（P<0.01）。與模型組相比，OMT高、中、低劑量給藥組及水飛薊素陽(yáng)性對(duì)照組大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶ALT和AST含量均顯著（P<0.05）降低。與陰性對(duì)照組相比，模型組大鼠血清GSH含量極顯著（P<0.01）下降。與模型組相比，水飛薊素陽(yáng)性對(duì)照組大鼠肝組織GSH表達(dá)量顯著上調(diào) （P<0.05）；OMT高劑量和中劑量給藥組GSH含量極顯著（P<0.01）升高，而低劑量給藥組GSH含量顯著（P<0.05）升高，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 OMT對(duì)肝纖維化大鼠血清ALT、AST和GSH的影響

表2 OMT對(duì)肝纖維化大鼠肝組織勻漿中TGF-β1含量的影響

2.2 OMT對(duì)硫代乙酰胺誘導(dǎo)的肝纖維化模型大鼠肝組織勻漿中TGF-β1含量的影響

陰性對(duì)照組大鼠肝組織TGF-β1表達(dá)量很少。與陰性對(duì)照組相比，模型組大鼠肝組織TGF-β1含量極顯著（P<0.01）升高。與模型組相比，OMT高、中、低劑量給藥組大鼠肝組織中TGF-β1含量顯著（P<0.05）下降（見(jiàn)表 2）。

3 討論

慢性肝病進(jìn)展成肝硬化必須要經(jīng)歷肝纖維化階段，它是影響慢性肝病預(yù)后的重要環(huán)節(jié)[6-7]。研究肝損害和肝纖維化最常用的模型是用硫代乙酰胺誘導(dǎo)大鼠肝損傷。其機(jī)制為硫代乙酰胺能造成大鼠肝細(xì)胞膜的脂質(zhì)破壞和蛋白變性，細(xì)胞膜受損，細(xì)胞內(nèi)酶外漏，血清ALT和AST活性增高[8]。 ALT、AST 含量越高，提示肝纖維化及肝硬化的程度越重。Saleh等[9]研究結(jié)果表明，二氫吲哚衍生物能夠顯著降低急性小鼠肝損傷模型中小鼠血清ALT和AST含量。該研究中，與陰性對(duì)照組比較，模型組大鼠血清ALT、AST水平極顯著升高，表明模型組大鼠肝損傷形成。與模型組比較，OMT高、中、低劑量給藥組大鼠血清ALT和AST含量顯著降低，表明OMT高、中、低劑量給藥組能減輕肝損傷，改善肝臟功能，延緩肝纖維化的形成。

GSH為抗氧化系統(tǒng)成員之一，是一種自由基清除劑，可以屏蔽各種過(guò)氧化物的毒性作用，在氧化應(yīng)激期間，GSH 的水平受到影響[10]，因此，GSH作為肝損傷的檢測(cè)補(bǔ)充指標(biāo)，其活性也可以特異性地代表肝損傷情況。Younis[11]等報(bào)告了CCl4誘導(dǎo)的肝組織損傷大鼠血清ALT、AST含量顯著升高，GSH 含量顯著降低。Wang 等[12]研究表明，沒(méi)食子?；鸾z桃酐可顯著升高氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的肝損傷大鼠血清GSH含量。該研究中，OMT高、中、低劑量給藥組能夠顯著升高被降低的肝纖維化大鼠血清GSH含量，并呈劑量依賴性。硫代乙酰胺（TAA）誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型中，肝細(xì)胞在清除產(chǎn)生的毒性自由基時(shí)消耗了較多的GSH[10]。模型組大鼠血清GSH含量顯著降低。當(dāng)給予不同劑量苦參素干預(yù)時(shí)，大鼠血清GSH含量顯著上升，并呈劑量依賴性。這是因?yàn)?，苦參素?duì)肝損傷有保護(hù)作用，可以延緩肝纖維化，給予20 mg/kg OMT時(shí)毒性自由基減少，肝臟中的GSH消耗的量減少，從而使GSH的含量升高。而隨著OMT劑量增加到40～80 mg/kg時(shí)，GSH含量的升高遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了陰性對(duì)照組，該現(xiàn)象可能與OMT劑量過(guò)高引起的毒性反應(yīng)有關(guān)[13]。該試驗(yàn)在給予40 mg/kg和80 mg/kg劑量苦參素所測(cè)得的GSH含量高于陰性對(duì)照組，出現(xiàn)該現(xiàn)象的具體原因還有待于深入研究。

TGF-β1表達(dá)的差異參與了肝纖維化從發(fā)生到發(fā)展整個(gè)過(guò)程[14-15]，說(shuō)明體內(nèi)肝纖維化程度與肝組織中TGF-β1表達(dá)的高低有密切關(guān)系。張英博等[8]研究表明，在CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化中，肝臟TGF-β1水平顯著增加，給予補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療40 d后的小鼠肝組織中TGF-β1水平顯著下降。李秧秧等[16]研究結(jié)果表明，糖尿病大鼠非酒精性脂肪型肝病纖維化模型中，與陰性對(duì)照組相比，模型組TGF-β1水平顯著增加，當(dāng)給予棉酚治療4～8周后，大鼠肝臟組織中TGF-β1水平顯著下降，病理檢查肝纖維化程度明顯減輕。在該試驗(yàn)中，陰性對(duì)照組大鼠肝組織表達(dá)TGF-β1的量極少，模型組大鼠肝組織TGF-β1的含量明顯高于陰性對(duì)照組（P<0.01），OMT高、中、低劑量給藥組大鼠肝組織中TGF-β1的表達(dá)被顯著下調(diào) （P<0.05）。TGF-β1對(duì)肝纖維化的調(diào)節(jié)作用可能是通過(guò)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮作用的，其與肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，是肝纖維化發(fā)生的主要信號(hào)傳導(dǎo)途徑[8，16-18]。

該研究表明，OMT可明顯降低肝纖維化模型大鼠肝臟組織中TGF-β1的基因表達(dá)，這個(gè)結(jié)果提示OMT抑制肝纖維化的機(jī)制之一可能是對(duì)TGF-β1表達(dá)的抑制。而苦參素對(duì)肝纖維化大鼠中TGF-β1下游因子如smads家族蛋白的調(diào)節(jié)作用，以及苦參素對(duì)肝纖維化大鼠細(xì)胞內(nèi)有關(guān)肝纖維化信號(hào)通路的影響，有待于進(jìn)一步的研究。