其布日，薩初拉，蘇少鋒，高 娃，王蘊(yùn)華，劉紅葵，吳青海，呼 和

（內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031）

目前絕大多數(shù)的酵母表達(dá)載體都將大腸桿菌來源的抗性標(biāo)記和大腸桿菌復(fù)制區(qū)整合到酵母基因組上，這對于食品安全而言是不利的[1-2]。食品級基因工程表達(dá)系統(tǒng)是指其宿主及表達(dá)載體為食品工業(yè)領(lǐng)域認(rèn)可的、安全完整的表達(dá)系[3]。構(gòu)建食品級表達(dá)系統(tǒng)時用到的宿主菌必須是食品級微生物GRAS，試驗材料、抗性標(biāo)記等都應(yīng)對環(huán)境及人體無毒害作用[4]。食品級工程菌株不能含有非食品級菌種來源的功能性DNA片段[5]。構(gòu)建食品級表達(dá)系統(tǒng)一般有3種方法。第1種方法是通過共轉(zhuǎn)化構(gòu)建食品級表達(dá)載體，即用2種載體：一種是能在宿主菌中復(fù)制的載體，另一種是帶有抗性標(biāo)記卻不含復(fù)制區(qū)的伴侶載體，將這2種載體共同轉(zhuǎn)化至宿主菌后，通過表型選擇和傳代培養(yǎng)獲得不含抗性標(biāo)記的轉(zhuǎn)化子。第2種方法是采用非抗生素抗性選擇標(biāo)記來構(gòu)建食品級表達(dá)載體[6-8]。第3種方法是通過同源重組來構(gòu)建食品級表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建載體時會有一些異源微生物的序列，可通過基因工程手段，例如重疊延伸PCR方法刪除異源序列，然后將食品級表達(dá)系統(tǒng)整合到宿主菌株染色體上，構(gòu)建食品級載體[9-10]。

重疊延伸PCR方法 （gene splicing by overlap extension PCR，SOE-PCR），即利用具有互補(bǔ)末端的引物，使PCR產(chǎn)物出現(xiàn)重疊鏈，通過重疊鏈延伸使不同來源的2條鏈完成拼接[11]。該方法不用酶切連接處理，引物只要與模板結(jié)合，使2段基因出現(xiàn)1個重疊區(qū)域，用重疊區(qū)域的長引物序列形成重疊鏈，使基因拼接或重組。SOE-PCR技術(shù)在基因點突變、基因敲除、大片段的插入及刪除[12]、基因融合等方面有廣泛的應(yīng)用[13-15]。該研究利用SOE-PCR技術(shù)將實驗室構(gòu)建的醇溶蛋白基因（zein）酵母表達(dá)載體PGZM18中的包括抗藥性標(biāo)記Amp在內(nèi)的細(xì)菌質(zhì)粒序列DNA片段刪除后，重新拼接構(gòu)建食品級酵母載體。在SOE-PCR中，2個重疊的DNA片段是分別從2個獨立的PCR擴(kuò)增反應(yīng)得到的，混合2次PCR產(chǎn)物，由于2個突變端引物有重疊區(qū)，重疊片段之間退火、延伸成異源雙鏈，加入外側(cè)引物進(jìn)行第2次PCR，即可得到目標(biāo)重組體。設(shè)計引物時需考慮重疊部分的長度以及幾組引物的Tm值相近度，以便第2步混合模板PCR基因融合擴(kuò)增順利進(jìn)行[16-17]。

表1 SOE-PCR引物序列

載體中原核基因序列刪除后，將真核基因轉(zhuǎn)化至被FDA認(rèn)定為食品級微生物的產(chǎn)朊假絲酵母中構(gòu)建食品級工程菌株。由于外源基因轉(zhuǎn)化到宿主中經(jīng)過多次傳代培養(yǎng)易出現(xiàn)外源基因丟失現(xiàn)象，因此，該研究進(jìn)一步對重組酵母菌株進(jìn)行了外源基因遺傳穩(wěn)定性的測定。通過開展食品級重組產(chǎn)朊假絲酵母菌的構(gòu)建及其遺傳穩(wěn)定性的評價，以期為飼料工業(yè)中食品級酵母工程菌株的構(gòu)建以及利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 質(zhì)粒載體：PGZM18原核載體由筆者所在的實驗室構(gòu)建保存；產(chǎn)朊假絲酵母菌株購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，編號為CICC 1769。

1.1.2 主要試劑：三羥甲基氨基甲烷（Tris-堿）、甘氨酸、胰化蛋白胨、酵母提取物均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；試驗中用到的內(nèi)切酶、DNA Marker購寶生物工程（大連）有限公司；DNA回收試劑盒 （E.Z.N.A.TMGel Extraction Kit）購自O(shè)MEGA公司；引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物的設(shè)計與合成：分析載體質(zhì)粒序列真核及原核基因部分，以PGZM18原核載體質(zhì)粒（見圖1）為模板，根據(jù)參考文獻(xiàn)[17]進(jìn)行引物設(shè)計，相關(guān)引物序列見表1。

圖1 pBR322-GAP-zein-mL41-18S rDNA（PGZM18）載體質(zhì)粒圖譜

1.2.2 擴(kuò)增P1-1和P2-1基因片段：以PGZM18載體質(zhì)粒為模板進(jìn)行引物設(shè)計，分別以P1-1S、P1-1AS和 P2-1S、P2-1AS為引物，進(jìn)行 A、B 2組PCR試驗。A組PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性1 min；98℃變性 10 s，60℃退火 15 s，68℃延伸 6 min，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。B組PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 1 min；98℃變性10 s，60℃退火 15 s，68℃延伸 1 min， 共 30個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。A、B 2組各取5 μL PCR產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠（含1 μL/mL核酸染料）電泳檢測，利用紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，并用DNA回收試劑盒回收目的產(chǎn)物，A、B 2組的PCR產(chǎn)物片段大小分別約為5 085 bp和350 bp。

1.2.3 P1-1和P2-1 2個基因片段的拼接：將P1-1和P2-1 PCR回收產(chǎn)物混合為模板，以P1-1S、P2-1AS作為上、下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性1 min；98℃變性10 s，60℃退火15 s，68℃延伸6 min，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。將混合PCR回收產(chǎn)物命名為Mix1（見圖2），并將PCR產(chǎn)物送測序。

圖2 SOE-PCR引物設(shè)計以及刪除原核序列后的GAP-zein-mL41-18S rDNA（GZM18）結(jié)構(gòu)示意圖

1.2.4 刪除原核DNA序列后轉(zhuǎn)化至酵母菌株

1.2.4.1 酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備：將保存于-80℃的產(chǎn)朊假絲酵母進(jìn)行復(fù)蘇，在YPD固體培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)2～3 d。選擇1個單克隆接種于3 mL YPD培養(yǎng)基中，于30℃條件下50 r/min振蕩培養(yǎng)8 h。從上一步取5 μL菌液加入50 mL YPD培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，直到菌液OD值達(dá)到0.15～0.30（培養(yǎng)16～20 h）。將菌液倒入50 mL離心管中進(jìn)行離心，棄掉上清液，用新的100 mL YPD培養(yǎng)基重懸沉淀物，然后再進(jìn)行搖菌培養(yǎng)，直到菌液OD值達(dá)到 0.4～0.5（培養(yǎng) 3～5 h）。 將 100 mL 菌液分裝到 2個50 mL離心管中離心，棄掉上清液，用30 mL滅菌水重懸，室溫離心5 min，棄上清液，加入1.5 mL 1.1×TE/LiAc重懸細(xì)胞。將重懸液轉(zhuǎn)到1.5 mL離心管中高速離心15 s，棄上清液，加入600 μL 1.1×TE/LiAc重懸細(xì)胞，然后進(jìn)行PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化。

1.2.4.2 酵母轉(zhuǎn)化試驗：在反應(yīng)管中加入PCR產(chǎn)物 Mix1 （100 ng/μL）、Yeastmaker Carrier DNA（10 μg/μL）5 μL、酵母感受態(tài)細(xì)胞 50 μL，輕輕混勻，然后加入500 μL PEG/LiAC輕輕混勻，30℃培養(yǎng)30 min，每隔10 min輕輕混勻1次。加入20 μL DMSO混勻，42℃水浴15 min，每隔5 min輕輕混勻1次，然后高速離心30 s。加入1 mL YPD Plus Medium，30℃培養(yǎng) 90 min，高速離心 30 s，棄上清液，加入1 mL 0.9%NaCl溶液重懸，然后涂布于YPD/CYH（20 μg/mL）平板上，30 ℃培養(yǎng) 3～5 d。

1.2.4.3 酵母重組子的基因組PCR鑒定：對上一步生長在YPD/CYH（20 μg/mL）平板上的重組酵母菌提取基因組，以酵母基因組為模板，設(shè)計3組不同的引物鑒定陽性克隆，分別為 Z1、Z2，3S、3AS，5S、5AS。

①根據(jù)外源目的基因序列zein設(shè)計的引物：引物Z1、Z2的序列及擴(kuò)增目的片段大小見表2。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，53℃退火 30 s，72℃延伸 1 min， 共 30個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。 取5 μL PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠（含1 μL/mL核酸染料）電泳檢測，利用紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

②根據(jù)載體序列GAP-zein-mL41（GZM）設(shè)計的引物：引物3S、3AS的序列及擴(kuò)增目的片段大小見表3。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性 30 s，58℃退火 30 s，72℃延伸 4 min， 共 30個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。取5 μL PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠 （含1 μL/mL核酸染料）電泳檢測，利用紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

③根據(jù)載體序列GAP-zein-mL41-18S rDNA（GZM18）設(shè)計的引物：引物5S、5AS的序列及擴(kuò)增目的片段大小見表4。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性 2 min；94℃變性 30 s，58℃退火 30 s，72℃延伸5 min，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。取5 μL PCR產(chǎn)物用 1%瓊脂糖凝膠 （含1 μL/mL核酸染料）電泳檢測，利用紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.2.5 外源基因遺傳穩(wěn)定性測定

1.2.5.1 酵母菌落計數(shù)：將酵母重組子接種于5 mL YPD培養(yǎng)基中，于28℃條件下100 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。取1 mL菌液用生理鹽水稀釋105倍，分別取100 mL菌液涂布于YPD（不含CYH）和 YPD/CYH （20 μg/mL）2 種固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)24 h，第2天（記為Day 1）分別計數(shù)2種平板上形成的菌落數(shù)，YPD（不含CYH）固體培養(yǎng)基的菌落計數(shù)結(jié)果以 A1 表示，YPD/CYH（20 μg/mL）固體培養(yǎng)基的菌落計數(shù)結(jié)果以A2表示。將菌液接種于新鮮YPD培養(yǎng)基中，每隔24 h轉(zhuǎn)接1次，連續(xù)轉(zhuǎn)接15次，使總的繁殖時間為360 h。每次轉(zhuǎn)接前測定菌液OD600nm值，測定結(jié)果以N表示。每次轉(zhuǎn)接后的初始OD600nm值為0.1左右，以使其一直處于生長狀態(tài)。轉(zhuǎn)化子經(jīng)過360 h（記為Day 15）生長后進(jìn)行菌落計數(shù)，用同樣的方法稀釋菌體細(xì)胞，并分別涂布于上述2種固體培養(yǎng)基上，待長出單菌落后，菌落計數(shù)結(jié)果分別以B151和B152表示。質(zhì)粒穩(wěn)定性的計算公式為：A2×B151/A1×B152[18-19]。

表2 zein基因引物信息

表3 GAP-zein-mL41（GZM）引物信息

表4 GAP-zein-mL41-18S rDNA（GZM18）引物信息

圖3 引物P1-1和P2-1 PCR產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果

圖4 zein基因的PCR鑒定結(jié)果

圖5 GAP-zein-mL41（GZM）PCR鑒定結(jié)果

1.2.5.2 酵母基因組PCR檢測：將酵母重組子用上一步的培養(yǎng)方法，分別用YPD（不含CYH）和YPD/CYH（20 μg/mL）2 種固體培養(yǎng)基進(jìn)行接種傳代培養(yǎng)后，選取第1、7、15天的酵母菌培養(yǎng)物提取酵母基因組，利用PCR檢測目的基因，測定外源基因遺傳穩(wěn)定性[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 P1-1和P2-1 2個基因片段擴(kuò)增PCR產(chǎn)物鑒定結(jié)果

分別利用 P1-1S、P1-1AS 和 P2-1S、P2-1AS引物進(jìn)行A、B 2組PCR試驗。由圖3可知，獲得的P1-1和P2-1產(chǎn)物片段大小分別為5 085 bp和350 bp左右，與預(yù)期擴(kuò)增大小相符。

圖6 GAP-zein-mL41-18S rDNA（GZM18）PCR 電泳圖

2.2 P1-1和P2-1拼接產(chǎn)物的鑒定結(jié)果

將P1-1和P2-1的PCR回收產(chǎn)物混合為模板，以P1-1S和P2-1AS分別作為上、下游引物進(jìn)行PCR試驗。獲得的P1-1和P2-1拼接產(chǎn)物Mix1的片段大小為5 396 bp。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，結(jié)果表明，Mix1的序列與預(yù)測的載體真核序列完全一致，表明原核基因序列刪除，食品級序列拼接成功。

2.3 酵母重組子鑒定結(jié)果

以酵母重組子基因組為模板進(jìn)行PCR鑒定。zein基因引物Z1、Z2的PCR產(chǎn)物大小為453 bp（見圖 4），載體序列 GAP-zein-mL41（GZM）引物3S、3AS 的 PCR 產(chǎn)物大小為 3 620 bp（見圖 5），載體序列 GAP-zein-mL41-18S rDNA（GZM18）引物5S、5AS的PCR產(chǎn)物大小為4 446 bp（見圖6）。

2.4 外源基因遺傳穩(wěn)定性測定結(jié)果

2.4.1 菌落計數(shù)方法檢測遺傳穩(wěn)定性：外源基因在宿主產(chǎn)朊假絲酵母基因組上的遺傳穩(wěn)定性檢測結(jié)果見圖7，不同培養(yǎng)時間及不同培養(yǎng)基中的酵母菌落計數(shù)結(jié)果見表5。由表5可知，整合型重組質(zhì)粒在酵母的基因組中有良好的穩(wěn)定性，培養(yǎng)100代左右，外源基因在重組酵母中仍能夠穩(wěn)定存在。根據(jù)表5中列出的相關(guān)數(shù)據(jù)，利用上述質(zhì)粒穩(wěn)定性計算公式，得到質(zhì)粒穩(wěn)定性結(jié)果為0.93。

2.4.2 PCR檢測目的基因鑒定遺傳穩(wěn)定性：提取重組酵母基因組DNA，利用zein基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。由圖8可知，目的基因穩(wěn)定存在，在酵母菌傳代100代時仍含有目的條帶，表明外源基因沒有丟失，在傳代培養(yǎng)過程中保持了較高的遺傳穩(wěn)定性。

3 討論與結(jié)論

該研究利用SOE-PCR技術(shù)，刪除原有載體PGZM18中包含抗藥性標(biāo)記Amp在內(nèi)的細(xì)菌質(zhì)粒序列DNA片段及原核復(fù)制區(qū)序列；將真核基因序列通過同源重組技術(shù)轉(zhuǎn)化至產(chǎn)朊假絲酵母染色體中；重組酵母菌株經(jīng)過多次傳代培養(yǎng)，通過菌落計數(shù)和外源基因PCR方法鑒定整合到染色體上的外源基因具有較好的遺傳穩(wěn)定性，從而獲得遺傳穩(wěn)定的食品級酵母工程菌株。食品級基因工程菌在工業(yè)生產(chǎn)的應(yīng)用日益增多，而在食品、醫(yī)藥、飼料等領(lǐng)域的應(yīng)用則需要更安全的食品級工程菌株。然而，構(gòu)建的食品級工程菌株能否最終應(yīng)用于工業(yè)領(lǐng)域，使重組酵母菌株進(jìn)行大規(guī)模的培養(yǎng)以及外源基因的大量表達(dá)等還需更多的深入研究。

圖7 遺傳穩(wěn)定性試驗中不同培養(yǎng)時間及不同培養(yǎng)基中的酵母菌落生長情況

圖8 外源基因zein遺傳穩(wěn)定性PCR檢測結(jié)果

表5 不同培養(yǎng)時間及不同培養(yǎng)基中的酵母菌落計數(shù)結(jié)果