白靜瑩 王立山 張 媛 范桂枝

（東北林業(yè)大學生命科學學院，黑龍江哈爾濱150000）

桑黃（Phellinus yucatanenisis）屬于擔子菌亞門、多孔菌目、多層孔菌科、針層孔菌屬[1]，是一種珍貴而功效多樣的藥用真菌，有“森林黃金”之美稱。桑黃最早使用記錄是從漢朝開始的，至今已有2000多年的歷史，中醫(yī)用以治療血崩、血淋、帶下、脾虛泄瀉等[2-3]?，F(xiàn)代藥理研究表明，桑黃含有多糖、黃酮、三萜酸、脂肪酸類、芳香酸等成分[4]，具有抗菌、抗癌、抗氧化、抗肝纖維化和增強免疫等藥用價值[5-6]，是國際公認的最佳抗癌真菌之一。因此，桑黃作為名貴的滋補藥材，市場對其需求驟升。

野生桑黃人工栽培難度大、子實體生長周期長，一般3～4年，這限制了對桑黃的進一步開發(fā)和利用。為了滿足日益增長的市場需求，選育性狀穩(wěn)定、子實體生長周期短和人工栽培難度小的桑黃菌種成為一項重要的工作。原生質體技術是選育優(yōu)良菌種行之有效的手段，如原生質體融合、原生質體誘變和原生質體基因轉化等。其中，原生質體的制備和再生是原生質體技術的前提和基礎。祝子坪和馬海樂[7]、許謙[8]的研究分離了桑黃菌絲原生質體并成功再生，但是上述研究均未報道桑黃菌種的寄生樹種。研究表明，桑黃孔菌屬（Sanghuangporus）常與其所生長的樹木之間存在種類專一性關系[9]，目前知道世界上桑黃屬有12種[10-12]，主要生長于楊、松、桑、白樺、暴馬丁香、杜鵑等樹的樹干上[13]。不同寄生樹種來源的桑黃菌絲中，藥用代謝物含量可能存在差異[14]，其分離的原生質體活力、產(chǎn)量和再生能力是否相同還未見報道。為此，筆者將比較分析來源于暴馬丁香、桑樹、松樹、樺樹、楊樹桑黃等五種桑黃菌絲的原生質體活力和產(chǎn)量以及葡萄糖和pH對原生質體再生的影響，為利用原生質體技術選育優(yōu)良桑黃菌種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株、試劑與培養(yǎng)基

1.1.1 供試材料

五種不同樹種的桑黃子實體分別為暴馬丁香桑黃（Sanghuangporus baumii）、桑樹桑黃（Sanghuangporus sanghuang）、松樹桑黃（Phellinus igniarius Linn）、樺樹桑黃（Phellinus igniarius）、楊樹桑黃（Sanghuangporus vaninii），均由東北林業(yè)大學生命科學學院森林生物工程學科實驗室提供，該菌種已從形態(tài)和分子水平鑒定[15]。

1.1.2 主要試劑

崩潰酶（北京索萊寶科技有限公司），蝸牛酶（北京百泰生化技術公司），二乙酸熒光素（FDA）（上海瑞永生物科技有限公司），由本地市場購得葡萄糖、甘露醇等均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g沸水煮30 min，4層紗布過濾。取濾液，加入20 g葡萄糖，補水至1000 mL，pH自然。

PDA培養(yǎng)基：PDB培養(yǎng)基再加10%瓊脂粉。

原生質體再生培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨2 g，酵母粉4 g，溶于0.6 moL/L滲透壓穩(wěn)定劑中，體積為1000 mL，加入10%瓊脂粉，pH自然。

1.2 主要儀器與設備

電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司），超凈工作臺（上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司），SHA-B水浴恒溫振蕩器（國旺儀器），TDZ5-WS臺式低速離心機，OLYMPUS熒光顯微鏡，酒精燈，移液槍，鑷子，0.22μm細胞篩，0.22μm微孔濾膜，尼龍紗布（64μm）等。

1.3 試驗方法

1.3.1 桑黃菌絲體的培養(yǎng)

取PDA斜面上生長旺盛的菌絲，接種于PDB培養(yǎng)基中，28℃，130 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)15 d左右，直至菌絲長成約1 cm的球狀。

1.3.2 原生質體制備

在超凈工作臺上，將五種桑黃菌絲用無菌水洗滌、去除表面水分后，每毫升酶解液加入300 mg菌絲，振蕩混勻，使酶液與菌絲體充分接觸。于35℃恒溫水浴鍋水浴，110 r/min振蕩酶解3 h。待酶解完成后，將五種桑黃菌酶解液用無菌雙層尼龍紗布（64μm）過濾，3800 r/min離心機離心10 min去上清液，將原生質體用滲透壓穩(wěn)定劑稀釋成懸液備用。

1.3.3 原生質體產(chǎn)量與活力統(tǒng)計

（1）原生質體活力測定（FDA染色法）：用丙酮將FDA配置成5 mg/mL溶液，將FDA溶液與原生質體懸液按比例1∶1混勻，分別在自然光與熒光顯微鏡下觀察五種桑黃的原生質體。在熒光顯微鏡下，有活力的原生質體發(fā)出綠色熒光，無活力的不發(fā)光。隨機選取3個視野，每個樣品重復3次，計算出在自然光下原生質體數(shù)和熒光下有活力的原生質體數(shù)，得出活力比。

原生質體活力比（%）=熒光下原生質體數(shù)（個）/自然光下原生質體數(shù)（個）×100

（2）原生質體產(chǎn)量的測定（血球計數(shù)板計數(shù)）：吸取五種桑黃原生質體懸液10μL于25×16血球計數(shù)板上，在顯微鏡下，分別在左上、右上、左下、右下、中間五個中方格，計數(shù)原生質體數(shù)目。每個樣品重復3次。

原生質體產(chǎn)量的計算：

原生質體的產(chǎn)量/mL=（a/5）×25 ×104×b

式中：a為5個中方格中原生質體總數(shù)；b為原生質體懸液稀釋倍數(shù)。

1.3.4 暴馬丁香桑黃的再生

1.3.4.1 不同葡萄糖濃度對暴馬丁香桑黃再生率的影響

取1000 mL馬鈴薯濾液，平均分為兩份，即對照組和試驗組。試驗組加入54.65 g甘露醇使其濃度為0.6 mol/L，然后試驗組和對照組平均分成五份，分別加入一定量葡萄糖使其葡萄糖濃度分別為0.01 g/mL、0.02 g/mL、0.03 g/mL、0.04 g/mL、0.05 g/mL，pH自然，每份加1 g瓊脂，溶解后121℃、滅菌20 min。每個樣品重復3次。

1.3.4.2 不同pH對暴馬丁香桑黃再生率的影響

取1000 mL馬鈴薯濾液，加入葡萄糖20 g，平均分為兩份，即對照組和試驗組。試驗組加入54.65 g甘露醇使其濃度為0.6 moL/L，然后試驗組和對照組平均分成五份，調(diào)節(jié)pH為一定值。每份加1 g瓊脂，溶解后121℃、滅菌20 min。桑黃菌絲生長最適pH為 7.5，所以設定pH 五個梯度為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5。每個樣品重復3次。

1.3.5 釋放與再生的觀察

（1）桑黃原生質體的釋放：在酶解過程中，每隔1 h取樣制片，在顯微鏡下觀察原生質體形成情況。（2）桑黃再生：在無菌操作臺將桑黃精制后的懸液濃度調(diào)整為1×105個/mL，吸取100μL懸液涂到基礎培養(yǎng)基上，27.5℃避光條件下培養(yǎng)，隨時取樣制片，觀察桑黃原生質體再生過程。

2 結果與分析

2.1 原生質體的形態(tài)觀察

菌絲在酶解的過程中細胞壁被分解去除，形成的原生質體沒有了堅硬的細胞壁束縛，形態(tài)就會變?yōu)榍蛐位蛘呓蛐?。暴馬丁香、桑樹、松樹、樺樹、楊樹桑黃菌絲分別經(jīng)酶解液精制后得到的原生質體形態(tài)如圖1所示。五種桑黃菌絲的原生質體形態(tài)變?yōu)榍蛐位蚪蛐?，但楊樹桑黃原生質體形態(tài)與其他四種相比較不規(guī)則，可能是由于沒有了細胞壁的阻隔，原生質體可能會發(fā)生自然聚集或融合。進一步從熒光顯微鏡圖片可以看出桑樹和樺樹桑黃釋放的原生質體相似，均為細胞膜附近熒光較強，而暴馬丁香、松樹和楊樹桑黃釋放的原生質體相似，原生質體表面均有熒光分布。

2.2 原生質體的活力分析

暴馬丁香、樺樹、松樹、桑樹、楊樹桑黃的原生質體活力比分別為81.82%、76.67%、76.47%、71.58%、71.11%（圖2）。其中，暴馬丁香桑黃原生質體的活力最高，楊樹桑黃原生質體的活力最低，楊樹桑黃比暴馬丁香桑黃原生質體的活力降低了10%。

2.3 原生質體的產(chǎn)量分析

暴馬丁香、樺樹、松樹、桑樹和楊樹桑黃原生質體的產(chǎn)量分別為 3.85×105個/mL、3.14×105個/mL、2.85×105個/mL、3.57×105個/mL 和 2.42×105個/mL（圖3）。其中，暴馬丁香桑黃的產(chǎn)量最高，楊樹桑黃原生質體的產(chǎn)量最低，楊樹桑黃比暴馬丁香桑黃原生質體產(chǎn)量降低了1.43×105個/mL。

圖1 不同樹種桑黃原生質體鏡檢圖（10×60）

圖2 桑黃原生質體活力比

圖3 桑黃原生質體產(chǎn)量

圖4 不同pH對原生質體再生的影響

圖5 不同葡萄糖濃度對原生質體再生的影響

2.4 pH和葡萄糖濃度對桑黃菌絲原生質體再生率的影響

由上述圖2和圖3可知，暴馬丁香桑黃菌絲原生質體的活力比和產(chǎn)量最高，為此采用其分析pH和葡萄糖濃度對桑黃菌絲原生質體再生率的影響。pH 6.5～8.5，試驗組和對照組桑黃菌絲原生質體的再生率呈先上升后下降趨勢，其中試驗組在pH7時再生率達最高值23.67%，對照組在pH7.5時再生率達最高值23.34%（圖4）。

葡萄糖濃度對桑黃菌絲原生質體再生率的影響如圖5所示。葡萄糖濃度在10～50 mg/mL，試驗組呈先升高后降低趨勢，葡萄糖濃度在30 mg/mL時，原生質體再生率最高值19.33%，而對照組葡萄糖濃度在50 mg/mL時，原生質體的再生率最高為14.66%，其他葡萄糖濃度下再生率均在12%左右。

2.5 原生質體釋放與再生過程

桑黃菌絲酶解1～3 h，隨著酶解時間的增加，桑黃菌絲的細胞壁首先被降解，原生質體從側端釋放（圖6a），在酶解中期（圖6b、c），大部分菌絲被酶解為片段。該酶解過程與文獻報道一致，即大量菌絲由側端與頂端位膨脹，釋放更多原生質體[16]，被釋放后的原生質體在滲透壓穩(wěn)定劑作用下，呈現(xiàn)橢圓形或不規(guī)則形狀（圖6d）。

圖6 原生質體釋放與再生過程鏡檢圖（10×60）

桑黃原生質體再生過程中，桑黃原生質體首先萌發(fā)變成短狀棒粗菌絲（圖6e），短狀棒菌絲聚合進而再轉化為菌絲體（圖6f），菌絲體通過大量繁殖聚集變成桑黃菌株（圖6g、6h）。

3 小結

試驗以暴馬丁香、樺樹、松樹、桑樹、楊樹桑黃等五種桑黃為原料，進行了桑黃原生質體活力與產(chǎn)量的測定。選用暴馬丁香桑黃為材料，研究pH 6.5～8.5和葡萄糖濃度10～50 mg/mL對原生質體再生的影響，并對暴馬丁香桑黃原生質體釋放與再生過程進行顯微攝影觀察。結果表明：試驗所測定的五種桑黃中，暴馬丁香桑黃原生質體活力與產(chǎn)量最高，分別為81.82%和3.85×105個/mL。在pH 7時，暴馬丁香桑黃再生率最高為23.67%，葡萄糖濃度為30 mg/mL時，暴馬丁香桑黃的再生率最高為19.33%。初步摸索了桑黃菌株采用酶解法獲得的原生質體進行釋放與再生歷程，為以后該菌種誘變體系的建立奠定基礎。