牛善利，滿敏，牛傳貴

（山東省滕州市中心人民醫(yī)院 耳鼻喉科，山東 滕州 277500）

鼻咽癌（nasopharvnx cancer, NPC）是一種與EB病毒感染有關(guān)，發(fā)生于鼻咽腔頂部和側(cè)壁的惡性腫瘤。發(fā)病以男性居多，男性發(fā)病率約是女性發(fā)病率的2倍。NPC多在30歲以后開始發(fā)病，50～59歲發(fā)病人數(shù)最多，60歲后趨于平緩[1]。目前研究表明NPC的miRNA是一種非編碼RNA，在自然界廣泛分布，長度一般為22個核苷酸。miRNA對腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，關(guān)于miRNA-21、miRNA-135b和miRNA-141對癌細(xì)胞的作用已有一些報道，張彥兵等在一項肝癌研究中預(yù)測發(fā)現(xiàn)miRNA-135b的4個靶基因大型腫瘤抑制因子同源蛋白2（large tumor suppressor, homolog 2, LATS2）、轉(zhuǎn)錄因子β-Trcp（β-transducin repeats containing proteins, β-TrCP）、人源下游調(diào)節(jié)因子2（N-mycdown-streamregulator 2，NDR2）和亮氨酸拉鏈腫瘤抑制基因（leucine zipper putative tumor suppressor 1, LZTS1），并通過分析發(fā)現(xiàn)該基因均以不同的方式參與Hippo信號通路的活性狀態(tài)，從而調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白的表達(dá)[2]，但miRNA-135b對鼻咽癌相關(guān)研究的報道較少[3]。MURAKAMI等研究發(fā)現(xiàn)，惡性間皮瘤細(xì)胞株的LATS2基因表達(dá)缺失，由此推斷LATS2編碼的絲氨酸參與腫瘤抑制信號通路，其失活會誘使惡性間皮瘤細(xì)胞的增殖[4]。本研究通過檢測miRNA-135b對鼻咽癌CNE1細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，研究miRNA-135b的分子機制，為今后鼻咽癌的診治提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

RPMI 1640培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶（購自美國Thermo Scientific公司），胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）（購自北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所），鼻咽癌CNE1細(xì)胞及鼻咽部永生化上皮細(xì)胞NP69系（購自南京科佰生物細(xì)胞庫），LipofectamineTM2000、Trizol試劑（購自蘇州拜吉氏生物科技有限公司），microRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（購自北京索萊寶科技有限公司），RTPCR試劑盒（購自上海博谷公司），Transwell小室（購自美國Corning公司），基質(zhì)膠（購自美國BD公司），LATS2 m Ab（購自美國Cell Signaling Technology 公司），ECL發(fā)光試劑盒（購自美國Millipore公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 采用RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)鼻咽癌CNE1細(xì)胞系，培養(yǎng)基加鏈霉素與青霉素，濃度分別為150 u/L及150 mg/L，在37℃、50 ml/L二氧化碳CO2的培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，每3～4天用2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代。鼻咽部永生化上皮細(xì)胞NP69系接種于含10%胎牛血清的新鮮成分確定的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）檢測miRNA-135b的表達(dá) 采用RNA提取試劑提取鼻咽癌細(xì)胞株及正常鼻咽上皮永生化細(xì)胞中總RNA，測定濃度，置入-80℃冰箱冷凍保存。采用SYBR Green法檢測miRNA-135b的相對表達(dá)，反應(yīng)的循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性12 min，95℃變性35 s，60℃退火 30 s，70℃延伸35 s，共40個循環(huán)，最后71℃延伸9 min。該步驟重復(fù)3次。

1.2.3 引物設(shè)計及細(xì)胞轉(zhuǎn)染 在網(wǎng)站（http：//www.sanger.ac.uk/soft ware/Rfam/mirna）獲取人miRNA-135b的序列，設(shè)計其序列特異性引物，通過NCBI BLAST檢索程序排除其他的同源序列。擴增鼻咽癌CNE1細(xì)胞基因組DNA中的miRNA-135b的前體序列。PCR擴增的正、反向引物分別為5'-ATCGCTTGCACTGCAG GGACTGTCG-3'及5'-TCACGTTTCTGGAAACCAGC ACCGC-3'。構(gòu)建miRNA-135b的干擾載體并提取質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染前18 h，對擴增的鼻咽癌CNE1采用胰蛋白酶消化處理，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為104個/孔。共設(shè)3組，試劑對照組、空載體對照組和轉(zhuǎn)染組。運用LipfectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，提取RNA，測定濃度，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。通過RT-PCR檢測miRNA-135b基因的表達(dá)，以上的實驗操作重復(fù)3次。

1.2.4 Wertern blotting檢測目標(biāo)LATS2的表達(dá)Wertern blotting檢測過表達(dá)和干擾miRNA-135b的鼻咽癌CNE1細(xì)胞及對應(yīng)對照組細(xì)胞中LATS2的表達(dá)。過表達(dá)miRNA-135b的鼻咽癌CNE1細(xì)胞和干擾miRNA-135b的鼻咽癌CNE1細(xì)胞及各對照組細(xì)胞經(jīng)，低溫裂解40 min，高速離心20 min[3]，BCA定量法測定總蛋白濃度，采用110 V電壓進行電泳并恒壓轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜，20℃封閉80 min加入小鼠抗人LATS2 mAb（1∶500），4℃過夜，室溫封閉1 h；采用化學(xué)發(fā)光試劑曝光顯影，超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像。對Wertern blotting檢測結(jié)果進行半定量分析，LATS2的表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化后，計算轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中該蛋白的表達(dá)[5]。

1.2.5 Transwell實驗檢測鼻咽癌CNE1細(xì)胞侵襲能力 Transwell基質(zhì)膠上膠準(zhǔn)備完成后，在4℃下放置12 h[6]。采用無血清培養(yǎng)基37℃恒溫水化45 min；比較過表達(dá)miRNA-135b的鼻咽癌CNE1細(xì)胞（過表達(dá)組）與空載體細(xì)胞（空載體組），及干擾miRNA-135b的鼻咽癌CNE1細(xì)胞（干擾組）與空載體細(xì)胞（對照組）的侵襲能力。對4組細(xì)胞進行消化處理，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為2×105個/ml；下室加入細(xì)胞懸液800 μl。37℃、5% CO2培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)12 h；清理干凈后進行染色，并在200倍顯微鏡下隨機取15個視野計數(shù)。

1.2.6 LATS2活性檢測 胰酶消化轉(zhuǎn)染48 h后，按照20 μl每100萬細(xì)胞的比例加入裂解液，采用水浴法裂解細(xì)胞，4℃離心機，15 000 r/min離心12 min，取上清液。按照LATS2活性檢測試劑盒的操作說明書檢測實驗組和對照組的LATS2活性變化[7]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-135b在鼻咽癌CNE1細(xì)胞系的表達(dá)

CNE1細(xì)胞系miRNA-135b相對表達(dá)量為（4.85±0.41），而NP69細(xì)胞系相對表達(dá)量為（1.87±0.15），兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.813，P=0.014），miRNA-135b在鼻咽癌CNE1細(xì)胞系中的表達(dá)較NP69細(xì)胞高。

2.2 miRNA-135b不同表達(dá)程度對鼻咽癌CNE1細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響

過表達(dá)組與空載體組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.212，P=0.012），過表達(dá)miRNA-135b的鼻咽癌CNE1細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力有所增加（見圖1A～B）。Transwell實驗結(jié)果顯示，干擾組與對照組細(xì)胞比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=9.330，P=0.001），干擾組鼻咽癌CNE1細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力減弱（見圖1C～D）。

2.3 LATS2活性及表達(dá)

轉(zhuǎn)染24 h后LATS2蛋白的活性檢測結(jié)果顯示，空載體組與過表達(dá)及干擾組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=8.351，P=0.002）；對照組與干擾組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.420，P=0.011），LATS2的活性在過表達(dá)miRNA-135b的鼻咽癌CNE1細(xì)胞降低，而在干擾miRNA-135b的鼻咽癌CNE1細(xì)胞中增強，見圖2。Wertern blotting結(jié)果顯示，過表達(dá)miRNA-135b的鼻咽癌CNE1細(xì)胞中LATS2的表達(dá)水平有所下降，而干擾該miRNA后的鼻咽癌CNE1細(xì)胞中LATS2的表達(dá)水平有所增強，見圖3。

圖1 miRNA-135b不同表達(dá)程度對鼻咽癌CNE1細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響 （×40）

圖2 LATS2的活性

圖3 各組鼻咽癌CNE1細(xì)胞中LATS2蛋白的表達(dá)水平

3 討論

miRNA是一種可促進癌癥發(fā)生或者抑制癌癥發(fā)生的基因調(diào)節(jié)因子，在控制細(xì)胞生長、分化及凋亡等生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要的作用[8]，目前已有多種miRNA被發(fā)現(xiàn)與癌癥有關(guān)，其中miRNA-135b被證明在多種腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)均出現(xiàn)異常。miRNA-135b在結(jié)腸癌、肝癌、骨肉瘤等癌癥中均被發(fā)現(xiàn)呈高表達(dá)狀態(tài)[9]。多項研究表明，LATS2為抑癌基因，在腫瘤的發(fā)生和調(diào)節(jié)人類細(xì)胞周期中起到關(guān)鍵作用。作為LATS家族的新成員，LATS2在多種腫瘤組織中都為表達(dá)抑制或基因突變，然而在鼻咽癌組織中卻為過度表達(dá)，從而抑制鼻咽癌細(xì)胞的生長，誘導(dǎo)其凋亡。ZHANG等[10]在鼻咽癌鼻咽上皮用生化細(xì)胞株N96中檢測出LATS2的過度表達(dá)，提示LATS2可能在鼻咽癌組織中發(fā)揮促進癌細(xì)胞生長的作用。

本研究結(jié)果顯示，miRNA-135b在鼻咽癌CNE1細(xì)胞系中高表達(dá)，可能導(dǎo)致鼻咽癌CNE1細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強。Transwell實驗表明，miRNA-135b的過表達(dá)提高鼻咽癌CNE1細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，而對miRNA-135b進行干擾后，鼻咽癌CNE1細(xì)胞的侵襲和遷移能力下降。與miRNA-135b在其他癌癥的細(xì)胞實驗中的結(jié)果一致[5]。

有研究表明，miRNA-135b參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機制可能與Hippo信號通路，而LATS2基因是Hippo信號通路的相關(guān)基因[11-13]，LATS2具有抑癌作用，本研究通過對鼻咽癌CNE1細(xì)胞miRNA-135b的過表達(dá)和干擾發(fā)現(xiàn)，LATS2的活性和表達(dá)水平在過表達(dá)miRNA-135b的鼻咽癌CNE1細(xì)胞降低而在干擾miRNA-135b的鼻咽癌CNE1細(xì)胞中增強。說明miRNA-135b的表達(dá)可能通過影響LATS2活性影響鼻咽癌細(xì)胞的生長。

綜上所述，miRNA-135b的過表達(dá)可以引起鼻咽癌CNE1細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強，影響鼻咽癌細(xì)胞浸潤擴散，并可通過調(diào)節(jié)LATS2的活性和表達(dá)水平來調(diào)控癌變和惡性程度。干擾miRNA-135b可抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。miRNA-135b在鼻咽癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中可能起著重要的調(diào)節(jié)作用，通過調(diào)節(jié)LATS2或許能夠入核調(diào)控鼻咽癌的發(fā)生和惡性程度，但詳細(xì)的機制有待更進一步的研究。