張幸怡，林聰，劉禎，蘇衍菁，劉光磊

（光明牧業(yè)有限公司，上海 200436）

早在20世紀(jì)時(shí)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者便開始研究家畜精液的冷凍技術(shù)，目前精液冷凍技術(shù)經(jīng)過多年來的研究與發(fā)展，其技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟，并與人工授精技術(shù)相結(jié)合，廣泛應(yīng)用于家畜的繁育工作，能夠快速增加優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)家畜的數(shù)量，具有較高的商業(yè)價(jià)值。但在冷凍精液的制作和使用中往往會(huì)產(chǎn)生ROS（活性氧）等有害物質(zhì)，使精子活力及受胎率明顯不如新鮮精液，低質(zhì)量的冷凍精液會(huì)明顯降低家畜的受胎率，阻礙畜牧業(yè)的快速發(fā)展。

1 影響凍精精液品質(zhì)的因素

影響冷凍精液品質(zhì)的因素有很多，大致可分為兩類，一類是來自動(dòng)物本身之間的個(gè)體差異，一類是來自冷凍保存過程中的外在因素。

1.1 個(gè)體差異因素

動(dòng)物的受精率和胚胎發(fā)育與動(dòng)物個(gè)體有關(guān)，不同的個(gè)體會(huì)出現(xiàn)不同的結(jié)果。種畜的飼養(yǎng)就是為了延續(xù)優(yōu)良性狀，其途徑就是通過精液遺傳，而精液品質(zhì)的高低直接影響優(yōu)良性狀的延續(xù)，與種畜的使用價(jià)值密切相關(guān)。不同種畜的精液濃度、精子活性和精子形態(tài)等指標(biāo)不盡相同，而精子質(zhì)量好的種畜，更有可能產(chǎn)生人們需要的理想性狀的后代。關(guān)于個(gè)體差異對(duì)精液品質(zhì)影響的研究較早，郝愛玲等發(fā)現(xiàn)不同品種種公牛精液品質(zhì)差異較大，在采精量、鮮精活力、精子密度、凍后活力、生存時(shí)間和精子畸形率方面都有不同程度的差異[1]。謝莊等通過對(duì)不同國(guó)別種公牛精液品質(zhì)的分析，得出飼養(yǎng)在同一狀態(tài)下的不同國(guó)別的種公牛精液品質(zhì)存在差異的結(jié)論，其中中國(guó)的種公牛精液質(zhì)量不如其他國(guó)家，加拿大種公牛的精液質(zhì)量不如日本、美國(guó)和德國(guó)等國(guó)家[2]。

1.2 外在因素

冷凍精液在制作過程中，精液品質(zhì)會(huì)受到不同制作工藝的影響。冷凍保存過程中的外在因素主要包括精子稀釋液組成成分、冷凍保護(hù)劑的種類、解凍方法、平衡時(shí)間以及在體外操作過程中產(chǎn)生的ROS（活性氧）等有害物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，精子在冷凍-解凍后，其活力及受胎率明顯不如新鮮精液，這是因?yàn)榫釉谶@一過程中受到了冷凍損傷，其中氧化損傷是影響精子生理機(jī)能的主要因素之一[3]。精子在冷凍-解凍過程中產(chǎn)生過多的ROS，影響精液品質(zhì)，降低奶牛受胎率。針對(duì)該問題，國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過在精子稀釋液中添加外源抗氧化劑，以期提高解凍后精液品質(zhì)，例如添加維生素E、維生素C、維生素B12、抗氧化物酶、丁羥甲苯、谷胱甘肽、海藻糖和褪黑素等。其中褪黑素是一種具有較強(qiáng)抗氧化作用的胺類物質(zhì)，可通過清除多種ROS，激活多種抗氧化系統(tǒng)，以保護(hù)精子膜因冷凍-解凍過程所引起的氧化損傷，提高精子凍后品質(zhì)[4]。

2 褪黑素概述

褪黑素（melatonin，MLT）是由哺乳動(dòng)物和人類的松果體分泌的一種吲哚類神經(jīng)內(nèi)分泌素，是色氨酸的衍生物，能夠使一種產(chǎn)生黑色素的細(xì)胞顏色變淺，因而命名為褪黑素。有研究表明，視網(wǎng)膜、腸和副淚腺也可少量合成褪黑素；某些變溫動(dòng)物的眼睛、腦部和皮膚（如青蛙）以及某些藻類也能合成褪黑素[5]。褪黑素具有高度的親脂性和部分親水性，能穿透生理屏障發(fā)揮生理及病理作用。研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素具有較強(qiáng)的抗氧化作用，并有抗腫瘤、改善睡眠機(jī)制、提供免疫功能和生物節(jié)律性的功效。

活性自由基（ROS）是一類穩(wěn)定性差、半衰期短且化學(xué)性質(zhì)活潑的物質(zhì)，由機(jī)體通過酶促反應(yīng)和非酶促反應(yīng)產(chǎn)生。機(jī)體內(nèi)適當(dāng)數(shù)量的自由基可保證生物體正常的生理過程，具有一定的免疫、信號(hào)傳導(dǎo)和調(diào)節(jié)新陳代謝的功能。但當(dāng)機(jī)體受到有害刺激時(shí)（輻射、光照及其他外源性或內(nèi)源性誘因），體內(nèi)ROS含量的動(dòng)態(tài)平衡會(huì)發(fā)生破壞，ROS含量增多，會(huì)造成體內(nèi)正常細(xì)胞和組織損傷，破壞生物體正常生理過程，引發(fā)一系列疾病。褪黑素作為一種抗氧化劑，是一種強(qiáng)大的內(nèi)源性自由基清除劑，能夠?qū)沽u自由基對(duì)機(jī)體的攻擊以及谷氨酸興奮毒性作用，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有保護(hù)作用。一方面，褪黑素通過與自由基的結(jié)合來清除自由基，并通過一系列過程形成其他抗氧化成分。這使得褪黑素在被氧化的過程中，中間產(chǎn)物也具有抗氧化的特性，從另一層面上增加了褪黑素的抗氧化效果。據(jù)報(bào)道，褪黑素可保護(hù)由黃樟素所引起的DNA損傷[6]。高超的研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素可抑制因百草枯所引發(fā)的過氧化反應(yīng)及產(chǎn)生的自由基造成的細(xì)胞癌損傷[7]。另一方面，褪黑素可以保護(hù)機(jī)體內(nèi)存在的眾多抗氧化酶類，促進(jìn)抗氧化酶類活性的提高（如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽還原酶），保障抗氧化酶類催化還原物質(zhì)的生成或?qū)ψ杂苫那宄^程。研究表明，褪黑素可顯著提高中毒性肝炎小鼠體內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶及谷胱甘肽還原酶的活性[8]。Armagan等以糖尿病小鼠為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)褪黑素可提高糖尿病小鼠睪丸中超氧化物歧化酶及過氧化氫酶的活性[9]。褪黑素在機(jī)體內(nèi)的各種生理及病理過程中最終成為最強(qiáng)大的內(nèi)源性自由基清除劑。目前，褪黑素作為一種保護(hù)劑，已被廣泛應(yīng)用于因各種自由基所造成的組織損傷[10]。

3 褪黑素在改善凍精品質(zhì)上的研究進(jìn)展

有研究表明，褪黑素作為一種功能強(qiáng)大的抗氧化劑，可以提高精子線粒體活性、精子活力和頂體完整性，能夠在精液冷凍-解凍的過程中清除過多的ROS，提高精子質(zhì)量[11]。國(guó)內(nèi)早在2004年便有關(guān)于褪黑素的抗氧化作用對(duì)精液品質(zhì)影響的研究。商學(xué)軍等的研究表明，褪黑素通過其抗氧化能力，有效降低了ROS對(duì)精子線粒體功能的損傷[12]。近年來，褪黑素通過強(qiáng)大的抗氧化能力改善精液品質(zhì)的研究漸漸成為熱點(diǎn)，有研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)，褪黑素對(duì)精子的保護(hù)作用可能與其可穿過質(zhì)膜、清除自由基和減少氧化應(yīng)激有關(guān)；也可能是通過質(zhì)膜受體發(fā)揮作用[13]。國(guó)內(nèi)外已有許多將褪黑素應(yīng)用于家畜冷凍精液保護(hù)中的相關(guān)報(bào)道，探究褪黑素對(duì)精子的保護(hù)作用。

3.1 褪黑素在豬精液上的應(yīng)用

杜立銀等在經(jīng)冷凍保存的豬精液里添加適宜濃度的褪黑素，發(fā)現(xiàn)褪黑素具有抑制精子氧化損傷，提高解凍后精子活率、質(zhì)膜完整性和頂體完整性，顯著提高精子品質(zhì)的功能[14]。另外，褪黑素既可作為單獨(dú)的成分提供抗氧化能力，也可與其他抗氧化性物質(zhì)結(jié)合提高抗氧化性。楊寶衛(wèi)等通過研究豬精液冷凍稀釋液配方發(fā)現(xiàn)，10mmol/L的褪黑素和不同濃度的褪黑素和鹽酸多巴胺混合物（0.1、1和10mmol/L）均能有效改善凍后豬精子的畸形率和頂體完整性，有效改善解凍后豬精液品質(zhì)[15]。李博玲等的研究也表明，添加適量褪黑素能抑制豬精液冷凍過程中ROS的產(chǎn)生，且褪黑素與其他抗氧化物質(zhì)的聯(lián)合能有效提高抗氧化性[16]。Jang等將褪黑素分別添加至含有過氧化氫及無(wú)過氧化氫的公豬精液中，在37℃條件下培養(yǎng)3、6、9、12h，結(jié)果表明，精液中添加褪黑素組中的精子運(yùn)動(dòng)性、精子活力、精子存活率、膜完整性及線粒體活性均高于未添加組。進(jìn)一步佐證了褪黑素可保護(hù)公豬精液在冷凍保存過程中免受氧化損傷，提高公豬冷凍精液品質(zhì)[17]。

3.2 褪黑素在牛精液上的應(yīng)用

李曉霞等通過在牛精液稀釋液中添加不同濃度的褪黑素，經(jīng)過冷凍-解凍等一系列處理后發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組相比，10-3mol/L褪黑素可明顯改善牛精子活力、質(zhì)膜完整率和頂體完整率，提高牛精液的保存時(shí)間和保存質(zhì)量[18]。Li等通過研究褪黑素在性控精液生產(chǎn)中對(duì)水牛精液品質(zhì)的影響得出，褪黑激素有助于保護(hù)水牛精子免受染色、分選和冷凍過程中產(chǎn)生的活性氧的傷害，減少精液因ROS引起的氧化損傷，改善了分選和冷凍-解凍后的精子質(zhì)量，從而有助于優(yōu)化性控精液分選程序以及性控精子分離的應(yīng)用[11]。孫業(yè)清的試驗(yàn)表明，經(jīng)過褪黑素處理的牛冷凍精液，能顯著降低冷凍-解凍過程中精子細(xì)胞產(chǎn)生的ROS含量，提高精子質(zhì)膜、線粒體膜及頂體完整率，有效改善精液品質(zhì)[4]。Ashrafi等研究發(fā)現(xiàn)，在牛精液稀釋液中添加褪黑素可有效改善精子形態(tài)，顯著提高解凍后的精子活力及直線運(yùn)動(dòng)比例[19]。

3.3 褪黑素在羊精液上的應(yīng)用

Ashrafi以公羊精子為研究對(duì)象，探究在5℃、保存48h條件下，褪黑素對(duì)精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)的影響。結(jié)果表明，公羊精子稀釋液中添加適量的褪黑素可顯著提高公羊精子的運(yùn)動(dòng)參數(shù)[20]。kaya的研究表明，褪黑素可有效提升公羊精子冷凍-解凍后的精子存活率，同時(shí)與對(duì)照組相比，添加褪黑素可顯著降低精細(xì)胞中堿性磷酸酶的流失[21]。Hanif的研究發(fā)現(xiàn)，在公羊非繁殖季節(jié)給予褪黑素處理，可有效改善公羊精子品質(zhì)[22]。另外Webster觀察到，相比于對(duì)照組，經(jīng)過褪黑素處理的公羊精子，在50d后其精子個(gè)體的運(yùn)動(dòng)率較高[23]。Succu的研究表明，褪黑素可顯著提高精子DNA完整性及ATP濃度，提高凍后公羊精子活力[24]。

4 小結(jié)

大量的研究表明，褪黑素具有較強(qiáng)的抗氧化作用，可作為一種抗氧化劑添加到精子稀釋液中，用于提高家畜精液冷凍-解凍后品質(zhì)，改善受胎率。