李廣隆，劉思言，魯中爽，么夢凡，李遠強，關淑艷，姚 丹，曲 靜

（吉林農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，吉林 長春 130118）

非生物脅迫（干旱、鹽堿、高低溫以及重金屬離子等）對植物在不同生長階段都具有很大的負面影響，擾亂植物的正常生理代謝過程和細胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)，影響植物光合作用、蒸騰作用[1-2]。農(nóng)作物的減產(chǎn)很大程度上歸因于異常的自然氣候、土地鹽堿化、農(nóng)藥及化肥的過量使用、工業(yè)廢水的隨意排放等非生物脅迫，提高植物對非生物脅迫的耐受性對農(nóng)業(yè)發(fā)展中尤為重要[3]。

植物熱激蛋白（Hsps）是在植物遭遇非生物脅迫時，激活并能大量產(chǎn)生的一類蛋白質(zhì)。Hsps具備以下特征：（1）保守性較高，親緣關系較遠的生物體內(nèi)同一家族的Hsps同源性高，但非同一家族的Hsps無明顯同源性；（2）具有短時性，當植物受到非生物脅迫時，Hsps會在短時間內(nèi)大量表達積累，參與脅迫應答；（3）種類豐富，在線粒體、葉綠體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中都有定位，存在于不同細胞器中的Hsps具有不同的生物學功能，既可以獨特發(fā)揮，又能與其他蛋白協(xié)同互作[4-5]。

植物中Hsps比其他生物更加豐富和多樣化，結構保守的Hsps具有分子伴侶的功能，通過輔助蛋白質(zhì)的折疊、組裝、易位和降解，來維持蛋白質(zhì)和細胞膜的穩(wěn)定，保護植物正常生長具有積極作用[6]。在脅迫條件下，Hsps能幫助故障蛋白質(zhì)重新折疊，恢復正常的蛋白質(zhì)構象并因此維持細胞穩(wěn)態(tài)，對保護植物在非生物脅迫中免受損害起著至關重要的作用[7]。Hsps種類繁多，基因功能覆蓋廣泛，在植物抗旱方面作用明顯，同時在抗寒、抗鹽堿、抗氧化等非生物脅迫中也起到相關作用，是作物分子育種的一類良好研究對象，深入了解該蛋白有利于轉(zhuǎn)基因育種及新種質(zhì)的創(chuàng)新。

1 熱激蛋白概述

1962年意大利科學家Ritossa對高溫環(huán)境下的果蠅唾液腺進行研究時，首次發(fā)現(xiàn)了熱激蛋白[8]。1974年Tissieres將這種能被熱激條件刺激而合成的蛋白正式命名為熱激蛋白[9]。1992年Horwitz提出熱激蛋白屬于分子伴侶的一種[10]。所謂分子伴侶就是一類能介導其他多肽正確折疊，在某些情況下可暫時與其他蛋白結合，但不成為最終的功能結構，可防止蛋白有害積累的蛋白家族。熱激蛋白的分子伴侶作用有助于提高植物對脅迫的耐受力[11-12]。在隨后對熱激蛋白的研究中，多以動物材料為主，植物中熱激蛋白的研究起步較晚，尤其是在高等植物方面，但進展速度較快，目前已經(jīng)在大豆（Glycine max L.）、草莓（Fragaia ananassa Duchesne）、大麥（Hordeum ulgare L.）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）等植物中克隆得到了多種熱激蛋白基因[12-13]。

幾乎所有的生物體內(nèi)都有Hsps的存在，且高度保守。正常條件下的Hsps含量低于蛋白總量的5%，但在外界環(huán)境不利條件下，尤其是熱脅迫刺激時會大量合成，約占蛋白總量的15%[14-15]。Hsps有不同的分類方式，根據(jù)其分子量大小可以分為Hsp100、Hsp90、Hsp70、Hsp60、小熱激蛋白（small heat shock proteins, sHsps或Hsp20），其中高等植物中含有多達20～40種sHsps[16]。Hsps不僅參與植物對熱脅迫的響應，還廣泛的參與其他環(huán)境脅迫，例如水脅迫、鹽度和滲透、冷和氧化脅迫[17-18]。不同類別及定位在各細胞器中的Hsps相互作用，參與不同的細胞機制。同時Hsps發(fā)揮著分子伴侶的生物學功能，在保護植物免受脅迫和重建細胞穩(wěn)態(tài)方面起著重要作用[19-21]。

2 熱激蛋白生物學功能

2.1 Hsp60家族

Hsp60最初是被用來描述一類進化上與大腸桿菌GroEL同源的分子伴侶，是在原核生物和真核生物的線粒體與質(zhì)體中發(fā)現(xiàn)的一類分子伴侶，Hsp60被進一步分類為兩個亞家族，第一類分子伴侶存在于細菌、線粒體和葉綠體中，例如GroE和chCpn60，第二類伴侶蛋白CCT發(fā)現(xiàn)于古細菌和真核生物的細胞質(zhì)溶膠中。研究表明，Hsp60需要ATP水解釋放能量，參與新生肽的合成及折疊，通過協(xié)助新合成和新轉(zhuǎn)運的蛋白質(zhì)來實現(xiàn)其天然構象，在蛋白質(zhì)的合成過程中發(fā)揮著至關重要的作用[22-25]。

水稻（Oryza sativa）在氧脅迫的條件下，Hsp60過量表達，避免Fe/S酶釋放Fe2+，保護其不被氧化，在植物抵抗氧脅迫機制中發(fā)揮重要作用[26]。葉綠體Cpn60a基因的突變體擬南芥，在胚和幼苗的發(fā)育以及葉綠體發(fā)育過程中表現(xiàn)出生長缺陷[27]。在轉(zhuǎn)反義Cpn60b基因的煙草中，植株表型出現(xiàn)生長緩慢、葉片失綠、開花遲緩等明顯變化。在大腸桿菌中表達來自植物海蓮的CCTα蛋白可增強其對鹽分和滲透脅迫的耐受性[26]。但目前對Hsp60家族生物功能的探索還有待進一步發(fā)掘。

2.2 Hsp70家族

Hsp70家族被認為是最高度保守的Hsps。Hsp70家族在動物體內(nèi)修復變性蛋白、調(diào)控細胞凋亡和免疫防護等反應機制方面已有相關報道[28]；在高等植物中已經(jīng)鑒定出繁多的Hsp70蛋白，主要存在于植物的葉綠體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器中，在菠菜基因組中發(fā)現(xiàn)至少有12個Hsp70蛋白成員基因，擬南芥基因組包含至少18個編碼Hsp70家族成員的基因[29]。Hsp70家族中的一些成員是組成型表達的，這些成員參與輔助多肽的折疊和前體蛋白的運轉(zhuǎn)，引導溶酶體或蛋白酶來促進不穩(wěn)定蛋白的降解。

Hsp70家族中單個蛋白的特定功能可能取決于它們在亞細胞區(qū)室的不同位置，如細胞質(zhì)中的Hsp70有阻止蛋白聚集，幫助蛋白折疊，維持細胞器前體蛋白結構的作用，而線粒體和葉綠體Hsp70蛋白參與前體蛋白的輸入和易位[25]。分析發(fā)現(xiàn)Hsp70基因的過表達與植物有較強的耐熱性呈正相關，并能提高植物對鹽、水和高溫脅迫的耐受性[30-31]。已有研究表明耐熱品種的甜椒（Triticum aestivum）中CaHsp70的表達量呈上升趨勢，同時可提高甜椒植株的耐熱性[32]。研究還發(fā)現(xiàn)除高溫外ABA激素也會誘導黃瓜幼苗Hsp70基因的表達，從而提高其耐熱性，其原理是減少植株體內(nèi)H2O2的積累[33]。

植物Hsp70 BiP蛋白在未折疊蛋白細胞反應機制（UPR）中可起到保持積累的蛋白質(zhì)未折疊，從而避免在脅迫條件下的蛋白質(zhì)聚集，這一結果通過在煙草中過表達Hsp70 BiP基因得到證實[6]。另外Hsp70也可能充當熱激因子（HSF）介導的轉(zhuǎn)錄抑制因子，Hsp70與HSF之間的相互作用，負調(diào)控HSF介導的熱激反應中的轉(zhuǎn)錄激活，Hsp70蛋白還可能通過參與調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導通路中許多下游基因的表達而發(fā)揮廣泛的作用[34]。

2.3 Hsp90家族

Hsp90是需要ATP參與才能發(fā)揮生物學功能的主要分子伴侶之一，占細胞總蛋白的1%～2%[35]。在植物中，已經(jīng)在胞漿、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和質(zhì)體定位Hsp90基因，這些基因與酵母和動物來源的Hsp90具有63%～71%的氨基酸同源性[36]。Hsp90的特別之處在于與之相互作用的大多數(shù)底物是信號轉(zhuǎn)導蛋白，如類固醇激素受體和信號激酶[37]。最近的報告顯示，Hsp90蛋白可與其他蛋白合作，包括Hip（Hsp70相互作用蛋白）、Hop（Hsp70/Hsp90組織蛋白）、p23、Hsp40（DnaJ同源物）、免疫親合劑FKBP51/54和FKBP52以及 Cdc37/p50[38]。

盡管Hsp90蛋白在多數(shù)生物中是組成型表達的，但它們在原核生物和真核生物中的表達都隨著脅迫而增加，轉(zhuǎn)水稻熱激蛋白Hsp90基因的大豆品種中，可以有效提高其耐干旱能力[12]；有研究顯示，Hsp90還具有緩沖作用，在正常的生理條件下，遺傳變異的表達被Hsp90緩沖效應所隱藏或沉默，當生物遇到脅迫環(huán)境時，Hsp90緩沖系統(tǒng)會暴露出存在的隱藏突變[39-40]。這種形態(tài)進化的“緩沖”作用在擬南芥中被進一步證實，用凝膠霉素處理降低Hsp90的功能，使擬南芥產(chǎn)生了一系列形態(tài)表型，這可能是由于Hsp90在擬南芥中起到遺傳緩沖作用，釋放了正常情況下的遺傳變異，有助于該植物的進化適應[41]。

2.4 Hsp100家族

Hsp100家族是大型AAA ATPase超家族的成員，具有廣泛的功能特性，但與其他Hsps的生物學功能有所不同，其不具有防止蛋白質(zhì)聚集和錯誤折疊的常規(guī)伴侶功能[42]。Hsp100溶解聚集的蛋白質(zhì)，并在Hsp70系統(tǒng)的輔助下釋放，清除因錯誤折疊、變性或聚集引起的有害多肽，在蛋白質(zhì)分解和維持細胞動態(tài)平衡過程中發(fā)揮重要作用[43]。Hsp100執(zhí)行雙重伴侶和調(diào)節(jié)活性，從而影響蛋白底物的最終命運，所作用的蛋白底物要么完全降解，要么展開并釋放[44]。

Hsp100家族在擬南芥、蠶豆（Vicia faba）、煙草（Nicotiana）、水稻、玉米（Zea mays）、利 馬 豆（Phaseolus lunatus） 和 小 麥（Triticum aestivum）等植物中均有報道。與許多其他熱激蛋白一樣，Hsp100家族通常以組成型在植物中表達，受到如熱、冷、脫水、高鹽或暗誘導等不同的環(huán)境脅迫調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)小麥幼苗、玉米等在高溫脅迫下都能誘導合成 Hsp104，酵母中表達大豆GmHsp104基因，可以使酵母提高耐熱能力。從蠶豆中克隆其葉綠體Hsp100基因，證實了葉綠體Hsp100基因的表達與蠶豆的熱應激有關[45]。甘蔗Hsp100蛋白的產(chǎn)生賦予酵母有較強的耐熱性，暗示Hsp100在恢復細胞應力中發(fā)揮一定作用[46]。

2.5 sHsps家族

sHsps是一類低分子量的熱激蛋白（12～40 kDa）。植物中，sHsps在序列相似性、細胞定位和生物學功能方面比其他Hsps家族更加多樣化。原核和真核細胞中，sHsps在熱和其他脅迫下普遍合成，某些sHsps也在特殊發(fā)育階段表達[47]。sHsps本身不能重新折疊非天然蛋白質(zhì)，但在結合非天然蛋白質(zhì)方面具有顯著的效果，形成穩(wěn)定的復合體，使其接近其他依靠ATP的成員如Hsp70，從而協(xié)助蛋白質(zhì)的正確折疊和構型，以便進一步加工[14]。sHsps可能通過疏水相互作用，穩(wěn)定并防止蛋白質(zhì)非天然聚集，從而促進它們通過ATP依賴性伴侶蛋白（如DnaK或ClpB）的重折疊[48-49]。植物sHsps可以應對各種環(huán)境壓力，包括熱、冷、干旱、鹽度和氧化脅迫，sHsps還與類囊體膜相互作用，參與植物抗逆[44]。在石竹中已有葉綠體sHsps重要性的相關報道。而研究發(fā)現(xiàn)玉米線粒體sHsps（msHsp）在鹽脅迫期間顯示出保護NADH，改善線粒體電子傳遞的作用[51-52]。過表達sHsps基因可以減輕番茄對鹽脅迫的耐受性，桑樹內(nèi)質(zhì)網(wǎng)sHsps的積累可以增強其對寒冷脅迫的耐受性等越來越多的研究表明，sHsps的積累與植物對壓力耐受性之間存在很強的相關性[53-54]。

3 Hsps與其他應激反應機制的相互作用

非生物脅迫會引起多種反應，植物所獲得的耐受性通常是多種脅迫應答機制協(xié)調(diào)作用，重建細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，防止細胞損傷的結果[55-56]。脅迫條件下Hsps的保護作用可歸因于眾多伴侶的協(xié)同作用，發(fā)揮分子伴侶網(wǎng)絡機制[57-58]。

3.1 Hsps與滲透物分子相互作用

Hsps與滲透物分子機制互作是典型的例子，滲透物（如甘氨酸，甜菜堿，甘油，脯氨酸和海藻糖）是一類小分子量的有機化合物，在生物體中積累以響應滲透脅迫，細胞通過調(diào)節(jié)不同滲透物的細胞內(nèi)水平來特異性地控制蛋白質(zhì)的穩(wěn)定，影響蛋白質(zhì)解聚和重折疊[36]。研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌中的滲透物具有增加天然蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和協(xié)助未折疊多肽的重折疊來充當“化學伴侶蛋白”。對酵母的研究發(fā)現(xiàn)，海藻糖與Hsps相互作用，可抑制變性蛋白質(zhì)的聚集，使它們保持部分折疊狀態(tài)，從而恢復蛋白質(zhì)功能。發(fā)現(xiàn)鹵蟲（Artemia franciscana）在熱脅迫過程中和熱脅迫后，海藻糖和sHsp（p26）在體外可以協(xié)同作用[59]。這些研究為Hsps伴侶蛋白與其他壓力保護機制之間的相互作用提供了新見解。

3.2 Hsps與伴侶蛋白相互作用及調(diào)節(jié)細胞功能

除了滲透物外，還發(fā)現(xiàn)Hsp90、Hsp70家族的分子伴侶及其他伴侶蛋白與越來越多的信號分子之間有相互作用，包括核激素受體，酪氨酸、絲氨酸和蘇氨酸激酶，以及細胞周期和細胞凋亡調(diào)節(jié)劑，證明它們在細胞信號轉(zhuǎn)導網(wǎng)絡中發(fā)揮著關鍵作用[38]。哺乳動物細胞中sHsps不僅涉及對外界刺激的保護，而且還涉及其他細胞功能（例如細胞凋亡和分化）的調(diào)節(jié)，參與細胞氧化還原狀態(tài)的調(diào)節(jié)[60]。雖然這些研究大多數(shù)是在植物以外的生物體內(nèi)進行的，但類似的交叉互作機制可能在植物中同樣發(fā)揮作用。例如在擬南芥抗氧化應激轉(zhuǎn)錄因子的依賴性表達中，HSF不僅參與Hsps合成，還可參與抗氧化基因表達的相關氧化應激調(diào)節(jié)[61]。然而，Hsps作為細胞氧化還原狀態(tài)調(diào)節(jié)劑,參與植物其他應激反應機制仍有待確定。

4 問題與展望

每一類Hsps家族成員不但具有特定的功能，而且相互之間有著密切合作，構成不同的Hsps伴侶網(wǎng)絡。但在復雜的細胞環(huán)境中，特定的Hsps如何識別其特定的底物（新生肽或喪失功能的蛋白），以及怎樣決定每一種故障蛋白質(zhì)的處理方式，是對其保持穩(wěn)定還是防止聚集，是將其復性還是最終聚集并降解，是否存在Hsps伴侶網(wǎng)絡的中心決定因素，作為調(diào)控因子，Hsps是如何參與應激感應，信號轉(zhuǎn)導和應激基因的轉(zhuǎn)錄激活，這些問題尚不清楚。

目前植物和其他生物的大部分研究致力于檢測Hsps的低表達或過表達在應激期間或之后的變化。此外在許多情況下，關于Hsps在應激下的功能的結論是基于體外測定分析的結果，這主要是因為缺乏合適的突變體，有些特定的Hsps不發(fā)生表達。未來的研究應致力于創(chuàng)造缺乏特異性或幾種Hsps的植物突變體，并應用現(xiàn)有突變體的結果與之關聯(lián)分析。同時在研究植物中一種或多種應激反應機制變化中，還應該對Hsps蛋白的變化、結構變化要著重分析。在今后的研究中，期望能對Hsps和其他植物中應激反應機制之間互作關系的深入研究，進而為植物獲得性應激耐受性的研究提供理論依據(jù)。